ssmuБюллетень сибирской медициныBulletin of Siberian Medicine1682-03631819-3684Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation10.20538/1682-0363-2015-1-18-23ssmu-108Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL PAPERSДЕТЕКЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ DNMT3A ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ МЕТОДОМ ПРЯМОГО АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯDNMT3A GENE POINT MUTATIONS DETECTION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS USING SEQUENCING TECHNIQUEВиноградовА. В.VinogradovA. V.

Виноградов Александр Владимирович, кандидат медицинских наук, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики

vinogradov-av@russia.ruРезайкинА. В.RezaykinA. V.

Резайкин Алексей Васильевич, кандидат медицинских наук, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики

vinogradov-av@russia.ruСергеевА. Г.SergeevA. G.

Сергеев Александр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики

vinogradov-av@russia.ruМинистерство здравоохранения Свердловской области, Уральский государственный медицинский университет, ЕкатеринбургРоссияSverdlovsk Regional Ministry of Health, Ekaterinburg; Ural State Medical University, EkaterinburgRussian Federation2015280220151411823Copyright © Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г., 20152015Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г.Vinogradov A.V., Rezaykin A.V., Sergeev A.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/108

Цель исследования – определить частоту точечных мутаций гена DNMT3A при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) методом прямого автоматического секвенирования.Материал и методы. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 34 больных ОМЛ в возрасте от 21 до 64 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре (г. Екатеринбург) в период с 2012 по 2014 г., из них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 – 3 пациента, М1 – 1, М2 – 12, М3 – 3, М4 – 10, М5 – 2, М6 – 1, М7 – 1 пациент, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль обнаружена у одного больного. Выделение тотальной РНК из лейкозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе либо методом лизиса клеток с последующим связыванием РНК из раствора с мембраной (силикой) в миницентрифужной колонке с последующей обратной транскрипцией. Участки кДНК, соответствующие экзонам 18–26 гена DNMT3A, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Детекцию мутаций гена DNMT3A проводили методом прямого автоматического секвенирования с использованием генетического анализатора ABIPrism 310.Результаты. Функционально значимые точечные мутации гена DNMT3A обнаруживались в 5,9% проб, во всех случаях – при ОМЛ, развившихся в исходе миелодиспластического синдрома, и были представлены несинонимичными нуклеотидными заменами. Частота детекции указанных мутаций при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и точечных мутаций гена ТР53 составляла 14,3%, что сопоставимо с данными многоцентровых международных исследований. Наряду с мутациями гена DNMT3A в указанных образцах определялись точечные мутации генов NPM1, KRAS, WT1. Во всех наблюдениях ОМЛ с мутациями гена DNMT3A ассоциировались с низкой эффективностью стандартной программной полихимиотерапии циторабином в сочетании с антрациклиновыми антибиотиками и неблагоприятным прогнозом.

Aim: to estimate the frequency of DNMT3A gene exons 18–26 point mutations in acute myeloid leukemia (AML) patients (pts) using target automatic sequencing technique.Material and Methods. Bone marrow and peripheral blood samples were obtained from 34 AML pts aged 21 to 64, who were treated in Sverdlovsk Regional Hematological Centre (Ekaterinburg) during the period 2012–2014. Distribution of the pts according to FAB-classification was as follows: AML M0 – 3, M1 – 1, M2 – 12, M3 – 3, M4 – 10, M5 – 2, M6 – 1, M7 – 1, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm – 1. Total RNA was extracted from leukemic cells and subjected to reverse transcription. DNMT3A gene exons 18–26 were amplified by PCR. Detection of mutations in DNMT3A gene was performed by direct sequencing. Sequencing was realized using an automatic genetic analyzer ABI Prism 310.Results. The average frequency of functionally significant point mutations in DNMT3A gene exons 18– 26 among the treated AML pts was 5.9%. They were detected in morphological subgroups M2 and M4(according to WHO classification). The average frequency of DNMT3A gene exons 18–26 point mutations among the AML M2 and M4 pts without chromosomal aberrations and TP53 gene point mutations was 14.3%. In both cases there were samples in which DNMT3A gene mutations were accompanied by molecular lesions of NPM1, KRAS and WT1 genes. AML pts with DNMT3A gene exons 18–26 point mutations characterized by poor response to standard chemotherapeutic regimens and unfavorable prognosis.

точечная мутацияострый миелоидный лейкозген DNMT3Aпрямое автоматическое секвенированиеpoint mutationacute myeloid leukemiaDNMT3A genesequencingReferencesLey T.J., Ding L., Walter M.J., McLellan M.D., Lamprecht T., Larson D.E., Kandoth C., Payton J.E., Baty J., Welch J., Har-ris C.C., Lichti C.F., Townsend R.R., Fulton R.S., Dooling D.J., Koboldt D.C., Schmidt H., Zhang Q., Osborne J.R., Lin L., O'Laughlin M., McMichael J.F., Delehaunty K.D., McGrath S.D., Fulton L.A., Magrini V.J., Vickery T.L., Hundal J., Cook L.L., Conyers J.J., Swift G.W., Reed J.P., Alld-redge P.A., Wylie T., Walker J., Kalicki J., Watson M.A., Heath S., Shannon W.D., Varghese N., Nagarajan R., Westervelt P., Tomasson M.H., Link D.C., Grau¬bert T.A., DiPersio J.F., Mardis E.R., Wilson R.K. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // NEJM. 2010. V. 363, № 25. P. 2424–2433.Ley T.J., Ding L., Walter M.J., McLellan M.D., Lamprecht T., Larson D.E., Kandoth C., Payton J.E., Baty J., Welch J., Harris C.C., Lichti C.F., Townsend R.R., Fulton R.S., Dooling D.J., Koboldt D.C., Schmidt H., Zhang Q., Osborne J.R., Lin L., O'Laughlin M., McMichael J.F., Delehaunty K.D., McGrath S.D., Fulton L.A., Magrini V.J., Vickery T.L., Hundal J., Cook L.L., Conyers J.J., Swift G.W., Reed J.P., Alldredge P.A., Wylie T., Walker J., Kalicki J., Watson M.A., Heath S., Shannon W.D., Varghese N., Nagarajan R., Westervelt P., Tomasson M.H., Link D.C., Graubert T.A., DiPersio J.F., Mardis E.R., Wilson R.K. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. NEJM, 2010, vol. 363, no. 25, pp. 2424–2433.Thol F., Damm F., Lüdeking A., Winschel C., Wagner K., Morgan M., Yun H., Göhring G., Schlegelberger B., Hoelzer D., Lübbert M., Kanz L., Fiedler W., Kirchner H., Heil G., Krauter J., Ganser A., Heuser M. Incidence and prognostic influence of DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2011. V. 29, № 21. P. 2889–2896.Thol F., Damm F., Lüdeking A., Winschel C., Wagner K., Morgan M., Yun H., Göhring G., Schlegelberger B., Hoelzer D., Lübbert M., Kanz L., Fiedler W., Kirchner H., Heil G., Krauter J., Ganser A., Heuser M. Incidence and prognostic influence of DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. J. Clin. Oncol., 2011, vol. 29, no. 21, pp. 2889–2896.Marcucci G., Metzeler K.H., Schwind S., Becker H., Maharry K., Mrózek K., Radmacher M.D., Kohlschmidt J., Nicolet D., Whitman S.P., Wu Y.Z., Powell B.L., Car¬ter T.H., Kolitz J.E., Wetzler M., Carroll A.J., Baer M.R., Moore J.O., Caligiuri M.A., Larson R.A., Bloomfield C.D. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2012. V. 30, № 7. P. 742–750.Marcucci G., Metzeler K.H., Schwind S., Becker H., Maharry K., Mrózek K., Radmacher M.D., Kohlschmidt J., Nicolet D., Whitman S.P., Wu Y.Z., Powell B.L., Carter T.H., Kolitz J.E., Wetzler M., Carroll A.J., Baer M.R., Moore J.O., Caligiuri M.A., Larson R.A., Bloomfield C.D. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia. J. Clin. Oncol., 2012, vol. 30, no. 7, pp. 742–750.The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leu-kemia // NEJM. 2013. V. 368, № 22. P. 2059–2074.The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. NEJM, 2013, vol. 368, no. 22, pp. 2059–2074.Shlush L.I., Zandi S., Mitchell A., Chen W.C., Brandwein J.M., Gupta V., Kennedy J.A., Schimmer A.D., Schuh A.C., Yee K.W., McLeod J.L., Doedens M., Medeiros J.J., Marke R., Kim H.J., Lee K., McPherson J.D., Hudson T.J., HALT Pan-Leukemia Gene Panel Consortium, Brown A.M., Yousif F., Trinh Q.M., Stein L.D., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia // Nature. 2014. V. 506, № 7488. P. 328–333.Shlush L.I., Zandi S., Mitchell A., Chen W.C., Brandwein J.M., Gupta V., Kennedy J.A., Schimmer A.D., Schuh A.C., Yee K.W., McLeod J.L., Doedens M., Medeiros J.J., Marke R., Kim H.J., Lee K., McPherson J.D., Hudson T.J., HALT PanLeukemia Gene Panel Consortium, Brown A.M., Yousif F., Trinh Q.M., Stein L.D., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature, 2014, vol. 506, no. 7488, pp. 328–333.WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues / Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L., Jaffe E. S., Pileri S. A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. Lyon: IARC, 2008. 439 p.Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008. 439 p.Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мута-ций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Рос. он-колог. журн. 2013. № 4. С. 34–35.Vinogradov A.V. Technology development of CDKN2A/ARF gene mutations detection, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 during acute myeloid leukemia. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal – Russian Journal of Oncology, 2013, no. 4, pp. 34–35 (in Russian).Виноградов А.В., Резайкин А.В., Ивлева Е.К., Сергеев А.Г. Разработка технологии детекции мутаций гена ASXL1 при острых миелоидных лейкозах методом прямого ав-томатического секвенирования // Материалы Всероссий-ской конференции с международным участием «Совре-менные проблемы биохимии и биотехнологии», 25–27 сентября 2013 г. Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. С. 20–23.Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Ivleva Е.C., Sergeev A.G. Development of ASXL1 gene mutations detection technology in acute myeloid leukemia patients using direct sequencing method. Materials of Russian conference with international participation “Modern topics of biochemistry and biotechnology”, 25–27 September 2013. Ufa, Bashkir State University Publ., 2013. Pp. 20–23.Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов KRAS и NRAS при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автома-тического секвенирования // Вестн. Башкир. ун-та. 2014. Т. 19, № 3. С. 845–847.Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Sergeev A.G. KRAS and NRAS genes point mutations detection in acute myeloid leukemia patients using sequencing technique. Bulletin BSU, 2014, vol. 19, no. 3, pp. 845–847 (in Russian).Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and max-imum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28, № 10. P. 2731–2739.Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol., 2011, vol. 28, no. 10, pp. 2731–2739.Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V., Szpurka H., Huang Y., Traina F., Visconte V., Sugimoto Y., Prince C., O'Keefe C., Hsi E.D., List A., Sekeres M.A., Rao A., McDevitt M.A., Maciejewski J.P. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes as-sociated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A // Blood. 2011. V. 118, № 14. P. 3932–3941.Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V., Szpurka H., Huang Y., Traina F., Visconte V., Sugimoto Y., Prince C., O'Keefe C., Hsi E.D., List A., Sekeres M.A., Rao A., McDevitt M.A., Maciejewski J.P. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes associated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A. Blood, 2011, vol. 118, no. 14, pp. 3932– 3941.Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J., Zhang W., Zhang W.N., Xiong S.M., Gu Z.H., Wang K.K., Zeng R., Chen Z., Chen S.J. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression / DNA methylation in hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111, № 7. P. 2620–2625.Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J., Zhang W., Zhang W.N., Xiong S.M., Gu Z.H., Wang K.K., Zeng R., Chen Z., Chen S.J. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression. DNA methylation in hematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014, vol. 111, no. 7, pp. 2620–2625.Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р., Иощен-ко С.Е., Сергеев А.Г. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуноги-стохимического метода // Вестн. Урал. мед. академ. нау-ки. 2013. № 4. С. 124–127.Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Salakhov D.R., Ioschenko S.E., Sergeev A.G. Comparative Analysis of NPM1 gene mutations detection results using sequencing and immunohistochemical technique. Bulletin of Ural Medical Academic Science, 2013, no. 4, pp. 124–127 (in Russian).Subramaniam D., Thombre R., Dhar A., Anant S. DNA methyltransferases: a novel target for prevention and therapy // Front. Oncol. 2014. № 1. P. 80.Subramaniam D., Thombre R., Dhar A., Anant S. DNA methyltransferases: a novel target for prevention and therapy. Front. Oncol., 2014, no. 1, p. 80.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.