ssmuБюллетень сибирской медициныBulletin of Siberian Medicine1682-03631819-3684Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation10.20538/1682-0363-2020-3-6-14ssmu-3586Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL PAPERSКонформационные особенности лактатдегидрогеназы: влияние температурного фактора в присутствии малых молекул, математическая модельConformational features of lactate dehydrogenase: temperature effect in presence of small molecules, mathematical modelhttps://orcid.org/0000-0001-5992-3609ГильмияроваФ. Н.GilmiyarovaF. N.bio-sam@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5232-1549КузьмичеваВ. И.KuzmichevaV. I.

ординатор, кафедра фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой

Россия, 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89

КолотьеваН. А.KolotyevaN. A.

канд. мед. наук, доцент, кафедра фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой

ОRCID 0000-0002-7583-6222

Россия, 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89

https://orcid.org/0000-0001-6545-0035КомароваМ. В.KomarovaM. V.

канд. биол. наук, доцент, кафедра лазерных и биотехнологических систем

Россия, 443086, г. Самара, Московское шоссе, 34

34, Moscow Highway, Samara, 443086, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-8752-3837РыскинаЕ. А.RyskinaE. A.

д-р биол. наук, доцент, кафедра биохимии им. акад. Т.Т. Березова

Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6

6, Miklukho-Maklaya Str., Moscow, 117198, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0002-5619-4583ГусяковаО. А.GusyakovaO. A.

д-р мед. наук, зав. кафедрой фундаментальной и клинической биохимии с лабораторнойдиагностикой, зав. клинико-диагностической лабораторией клиник

Россия, 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89

ВиноградоваД. С.VinogradovaD. S.

отделение молекулярной и радиационной биофизики

Россия, 188300, Ленинградская обл., г. Гатчина, мкр. Орлова роща, 1

1, Mkr. Orlova Roscha, Gatchina, Leningradskaya Oblast, 188300, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-4441-9025СалминВ. В.SalminV. V.

д-р физ.-мат. наук, профессор, зав. кафедрой медицинской и биологической физики,

Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

1, Partizana Zeleznyaka Str., Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

Самарский государственный медицинский университет (СамГМУ)РоссияSamara State Medical UniversityRussian FederationСамарский национальный исследовательский университет им. акад. С.П. Королева (Самарский университет)РоссияSamara National Research UniversityRussian FederationРоссийский университет дружбы народов (РУДН)РоссияPeoples Friendship University of RussiaRussian FederationПетербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ)РоссияPetersburg Nuclear Physics Institute named after B.P. Konstantinov of National Research Centre "Kurchatov Institute"Russian FederationКрасноярский государственный медицинский университет (КрасГМУ) им. проф. В.Ф. Войно-ЯсенецкогоРоссияKrasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-YasenetskyRussian Federation202007102020193614Copyright © Гильмиярова Ф.Н., Кузьмичева В.И., Колотьева Н.А., Комарова М.В., Рыскина Е.А., Гусякова О.А., Виноградова Д.С., Салмин В.В., 20202020Гильмиярова Ф.Н., Кузьмичева В.И., Колотьева Н.А., Комарова М.В., Рыскина Е.А., Гусякова О.А., Виноградова Д.С., Салмин В.В.Gilmiyarova F.N., Kuzmicheva V.I., Kolotyeva N.A., Komarova M.V., Ryskina E.A., Gusyakova O.A., Vinogradova D.S., Salmin V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/3586Цель

Цель. Исследовать конформационные изменения лактатдегидрогеназы под действием различных концентраций интермедиатов (пируват, оксалоацетат) в температурном градиенте с последующим построением математической модели.

Материалы и методы

Материалы и методы. Изучение термолабильности лактатдегидрогеназы проводили с  использованием метода дифференциальной сканирующей флуориметрии по изменению  эндогенной флуоресценции триптофана и тирозина в условиях стабильной концентрации лактатдегидрогеназы и изменяющихся концентраций пирувата и оксалоацетата. Далее была разработана математическая модель для более углубленного рассмотрения поведения каталитического белка.

Результаты

Результаты. Было выявлено, что пируват и оксалоацетат в низких концентрациях оказывают термостабилизирующее воздействие на конформацию лактатдегидрогеназы, влияние пирувата статистически более значимо в сравнении с оксалоацетатом (p < 0,05). Изучаемые лиганды в высоких концентрациях снижают термостабильность лактатдегидрогеназы.

Заключение

Заключение. Понимание роли малых молекул в регуляции биологических и каталитических процессов долгое время оставалось в тени научного интереса, но сегодня работа в данном направлении выходит на качественно новый уровень.  Полученные данные свидетельствуют о возможности малых молекул выступать в качестве лигандов при взаимодействии с каталитическими белками.

The aim of this work was to study the conformational changes of lactate dehydrogenase under the influence of different concentrations of intermediates (pyruvate, oxaloacetate) in the temperature gradient with the  subsequent building of a mathematical model.

Materials and methods

Materials and methods. Thermolability of lactate dehydrogenase was studied using the method of differential scanning fluorimetry to determine the change in endogenous fluorescence of tryptophan and tyrosine under the conditions of stable concentration of lactate dehydrogenase and changing concentrations of pyruvate and oxaloacetate. Further, a mathematical model was developed for a more in-depth consideration of the behavior of the catalytic protein.

Results

Results. We found that pyruvate and oxaloacetate in low concentrations have a thermostabilizing effect on lactate dehydrogenase conformation; the effect of pyruvate is statistically more significant in comparison with oxaloacetate (p < 0.05). The studied ligands in high concentrations reduce the thermal stability of lactate dehydrogenase.

Conclusion

Conclusion. Understanding the role of small molecules in the regulation of biological and catalytic processes has long remained in the background of scientific interest, but today the work in this direction is reaching a new level. The data obtained indicate the possibility of small molecules acting as ligands when interacting with enzymes.  

лактатдегидрогеназаконформациядифференциальная сканирующая флуориметрияоксалоацетатпируватlactate dehydrogenaseconformationdifferential scanning fluorimetryoxaloacetatepyruvateReferencesCastoreno A.B., Ulrike U.S. Small molecule probes of cellular pathways and networks. ACS Chem. Bio. 2010; 6: 86–94. DOI: 10.1021/cb1002976.Castoreno A.B., Ulrike U.S. Small molecule probes of cellular pathways and networks. ACS Chem. Bio. 2010; 6: 86–94. DOI: 10.1021/cb1002976.Hörner M., Weber W. Molecular switches in animal cells. FEBS Lett. 2012; 586 (15): 2084–2096. DOI: 10.1016/j.febslet.2012.02.032.Hörner M., Weber W. Molecular switches in animal cells. FEBS Lett. 2012; 586 (15): 2084–2096. DOI: 10.1016/j.febslet.2012.02.032.Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger principles of biochemistry. 6th ed. New York: W.H. Freeman, 2013: 1158.Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger principles of biochemistry, 6th ed. New York: W.H. Freeman, 2013: 1158.Mendes-Mourao J., Halestrap A.P., Crisp D.M., Pogson C.I. The involvement of mitochondrial pyruvate transport in the pathways of gluconeogenesis from serine and alanine in isolated rat and mouse liver cells. FEBS Lett. 1975; 53 (1): 29–32. DOI: 10.1016/0014-5793(75)80674-0.Mendes-Mourao J., Halestrap A.P., Crisp D.M., Pogson C.I. The involvement of mitochondrial pyruvate transport in the pathways of gluconeogenesis from serine and alanine in isolated rat and mouse liver cells. FEBS Lett. 1975; 53 (1): 29–32. DOI: 10.1016/0014-5793(75)80674-0.McCommis K.S., Finck B.N. Mitochondrial pyruvate transport: a historical perspective and future research directions. Biochem. J. 2015; 466 (3): 443–454. DOI: 10.1042/BJ20141171.McCommis K.S., Finck B.N. Mitochondrial pyruvate transport: a historical perspective and future research directions. Biochem. J. 2015; 466 (3): 443–454. DOI: 10.1042/BJ20141171.Valvona C., Fillmore H.L., Nunn P.B., Pilkington G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathology. 2016; 26 (1): 3–17. DOI: 10.1111/bpa.12299.Valvona C., Fillmore H.L., Nunn P.B., Pilkington G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathology. 2016; 26 (1): 3–17. DOI: 10.1111/bpa.12299.Zhai X., Yang Y., Wan J., Zhu R., Wu Y. Inhibition of LDH-A by oxamate induces G2/M arrest, apoptosis and increases radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma cells. Oncol. Rep. 2013; 30: 2983–2991. DOI: 10.3892/or.2013.2735.Zhai X., Yang Y., Wan J., Zhu R., Wu Y. Inhibition of LDH-A by oxamate induces G2/M arrest, apoptosis and increases radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma cells. Oncol. Rep. 2013; 30: 2983–2991. DOI: 10.3892/or.2013.2735.Pioli P.A., Hamilton B.J., Connolly J.E., Brewer G., Rigby W.F. Lactate dehydrogenase is an AU-rich element-binding protein that directly interacts with AUF1. J. Biol. Chem. 2002; 277 (38): 35738–35745. DOI: 10.1074/jbc.M204002200.Pioli P.A., Hamilton B.J., Connolly J.E., Brewer G., Rigby W.F. Lactate dehydrogenase is an AU-rich element-binding protein that directly interacts with AUF1. J. Biol. Chem. 2002; 277 (38): 35738–35745. DOI: 10.1074/jbc.M204002200.Huang L., Li B., Li W., Guo H., Zou F. ATP-sensitive potassium channels control glioma cells proliferation by regulating ERK activity. Carcinogenesis. 2009; 30 (5): 737–744. DOI: 10.1093/carcin/bgp034.Huang L., Li B., Li W., Guo H., Zou F. ATP-sensitive potassium channels control glioma cells proliferation by regulating ERK activity. Carcinogenesis. 2009; 30 (5): 737–744. DOI: 10.1093/carcin/bgp034.Martin L., Schwarz S., Breitsprecher D. Analyzing thermal unfolding of proteins: the prometheus NT.48. Application note NT-PR-001. NanoTemper technologies GmbH, 2014. URL: https://resources.nanotempertech.com/application-notes/nanotemper-application-note-nt-pr-001-thermal-unfolding.Martin L., Schwarz S., Breitsprecher D. Analyzing thermal unfolding of proteins: the prometheus NT.48. Application note NT-PR-001. NanoTemper technologies GmbH, 2014. URL: https://resources.nanotempertech.com/application-notes/nanotemper-application-note-nt-pr-001-thermal-unfoldingCrawley M.J. The R book. John Wiley & Sons, Inc., 2007: 940.Crawley M.J. The R book. John Wiley & Sons, Ltd. 2007: 940.Findlay J.W., Dillard R.F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 2007; 9: 260–267.Findlay J.W., Dillard R.F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 2007; 9: 260–267. DOI: 10.1208/aapsj0902029.DOI: 10.1208/aapsj0902029.Rizzo J.M., Shi S., Li Y., Semple A., Esposito J.J., Yu S. Application of a high-throughput relative chemical stability assay to screen therapeutic protein formulations by assessment of conformational stability and correlation to aggregation propensity. Pharm. Sci. 2015; 104 (5): 1632–1640. DOI: 10.1002/jps.24408.Rizzo J.M., Shi S., Li Y., Semple A., Esposito J.J., Yu S. Application of a high-throughput relative chemical stability assay to screen therapeutic protein formulations by assessment of conformational stability and correlation to aggregation propensity. Pharm. Sci. 2015; 104 (5): 1632–1640. DOI: 10.1002/jps.24408.Goshu A.T., Koya P.R. Derivation of inflection points of nonlinear regression curves – implications to statistics. AJTAS. 2013; 2 (6): 268–272. DOI: 10.11648/j.ajtas.20130206.25.Goshu A.T., Koya P.R. Derivation of inflection points of nonlinear regression curves – implications to statistics. AJTAS. 2013; 2 (6): 268–272. DOI: 10.11648/j.ajtas.20130206.25.Magnusson A.O., Szekrenyi A., Joosten H.J., Finnigan J., Charnock S., Fessner W.D. nanoDSF as screening tool for enzyme libraries and biotechnology development. FEBS J. 2019; 286 (1): 184–204. DOI: 10.1111/febs.14696.Magnusson A.O., Szekrenyi A., Joosten H.J., Finnigan J., Charnock S., Fessner W.D. nanoDSF as screening tool for enzyme libraries and biotechnology development. FEBS J. 2019; 286 (1): 184–204. DOI: 10.1111/febs.14696.Chaudhuri R., Cheng Y., Middaugh C.R., Volkin D.B. High-throughput biophysical analysis of protein therapeutics to examine interrelationships between aggregate formation and conformational stability. AAPS J. 2014; 16 (1): 48–64. DOI: 10.1208/s12248-013-9539-6.Chaudhuri R., Cheng Y., Middaugh C.R., Volkin D.B. High-throughput biophysical analysis of protein therapeutics to examine interrelationships between aggregate formation and conformational stability. AAPS J. 2014; 16 (1): 48–64. DOI: 10.1208/s12248-013-9539-6.Chaudhuri R., Cheng Y., Middaugh C.R., Volkin D.B. High-throughput biophysical analysis of protein therapeutics to examine interrelationships between aggregate formation and conformational stability. AAPS J. 2014; 16 (1): 48–64. DOI: 10.1208/s12248-013-9539-6.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.