ssmuБюллетень сибирской медициныBulletin of Siberian Medicine1682-03631819-3684Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation10.20538/1682-0363-2021-4-25-31ssmu-4576Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL PAPERSВлияние нетоза на лизис фибринового сгустка при раке толстого кишечникаhe effects of NETosis on fibrinolysis in colon cancer patientshttps://orcid.org/0000-0002-1458-2385ПаршинаА. А.ParshinaA. A.

аспирант, кафедра патологической физиологии, 

672090, г. Чита, ул. Горького 39а

39a, Gorkogo Str., Chita, 672090

a.parshina.csma@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0975-2351ЦыбиковН. Н.TsybikovN. N.

д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической физиологии, 

672090, г. Чита, ул. Горького 39а

39a, Gorkogo Str., Chita, 672090

https://orcid.org/0000-0002-8601-3499ТерешковП. П.TereshkovP. P.

канд. мед. наук, вед. науч. сотрудник, лаборатория клинической и экспериментальной биохимии и иммунологии, НИИ молекулярной медицины, 

672090, г. Чита, ул. Горького 39а

39a, Gorkogo Str., Chita, 672090

https://orcid.org/0000-0002-0487-6275КараваеваТ. М.KaravaevaT. M.

канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория клинической и экспериментальной биохимии и  иммунологии, НИИ молекулярной медицины, 

672090, г. Чита, ул. Горького 39а

39a, Gorkogo Str., Chita, 672090

https://orcid.org/0000-0001-6308-3411МаксименяМ. В.MaksimenyaM. V.

 канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория клинической и экспериментальной биохимии и иммунологии, НИИ молекулярной медицины, 

672090, г. Чита, ул. Горького 39а

39a, Gorkogo Str., Chita, 672090

Читинская государственная медицинская академия (ЧГМА)РоссияChita State Medical Academy (CSMA)Russian Federation2021010120222042531Copyright © Паршина А.А., Цыбиков Н.Н., Терешков П.П., Караваева Т.М., Максименя М.В., 20222022Паршина А.А., Цыбиков Н.Н., Терешков П.П., Караваева Т.М., Максименя М.В.Parshina A.A., Tsybikov N.N., Tereshkov P.P., Karavaeva T.M., Maksimenya M.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/4576

Цель – изучение особенностей формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, а также их влияния на фибринолиз у лиц, имеющих злокачественные новообразования толстого кишечника.

Материалы и методы

Материалы и методы. Группу пациентов составили лица с впервые выявленным раком толстого кишечника 2–3-й стадии без метастаза (17 человек, средний возраст 67 лет); контрольную группу – доноры, сопоставимые по полу и возрасту, не имеющие злокачественных опухолей (30 человек, средний возраст 68 лет). Из цельной крови создали экспериментальную модель, включавшую бедную тромбоцитами плазму крови и изолированную культуру нейтрофилов, предварительно индуцированных к нетозу внесением 100 нмоль PMA, инкубировали 4 ч, клетки осаждали центрифугированием, плазму отбирали для дальнейшего исследования. В качестве контроля использовали плазму, инкубированную с интактными нейтрофилами. О степени активации клеток судили по уровню интерлейкина (IL) 8 и PSGL-1. Нетоз подтверждали измерением уровня нуклеосом и флуоресцентной микроскопией. Оценку фибринолиза проводили в тесте тромбодинамики. Результаты сопоставляли с концентрацией компонентов фибринолитической системы, измеренных методом проточной цитометрии.

Результаты

Результаты. В контроле индукция нетоза вызывает выраженную активацию нейтрофилов, сопровождающуюся повышением уровня IL-8, PSGL-1, плазминогена, снижением PAI-1 и усилением фибринолиза, в сравнении с интактными образцами. У пациентов зафиксирован больший, чем в группе контроля, уровень IL-8, PSGL-1, плазминогена, PAI-1 и показателей фибринолиза в интактных образцах. При этом индукция нетоза не привела к увеличению степени активации и значимому изменению данных показателей.

Заключение

Заключение. Гибель нейтрофилов путем нетоза в местах тромбообразования может способствовать как формированию, так и растворению фибринового сгустка. Однако у лиц со злокачественными новообразованиями «смертельный» нетоз не приводит к локальному увеличению фибринолитического потенциала ввиду истощения внутриклеточных резервов протеаз нейтрофилов, что может являться одним из механизмов развития гиперкоагуляции и недостаточности фибринолиза при онкопатологии. 

Aim

Aim. To investigate formation of neutrophil extracellular traps (NETs) and their impact on fibrinolysis in patients with colon cancer.

Materials and methods

Materials and methods. The study was performed in two groups. The experimental group consisted of patients with stage 2–3 non-metastatic colon cancer (n = 17, average age – 67 years). The control group included healthy volunteers matched by sex and age (n = 30, average age – 68 years). An experimental model was created from the whole blood. It included platelet-poor plasma and an isolated culture of neutrophils, previously induced to NETosis by adding 100 nmol PMA. The samples were incubated for 4 hours, then the test tubes were centrifuged to pellet cells and their remnants, and the plasma was transferred for subsequent examination. The plasma incubated with intact neutrophils was used as a control. The levels of interleukin-8 (IL-8) and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) were used to determine the degree of cell activation. NETosis was confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorescent microscopy. Fibrinolysis was assessed using the thrombodynamics test. The results were compared with the levels of fibrinolytic system components measured by flow cytometry.

Results

Results. In the control group, NETosis induction contributed to pronounced neutrophil activation that was accompanied by an increase in the IL-8, PSGL-1, and plasminogen levels, a decrease in PAI-1, and enhancement of fibrinolysis, compared with the intact samples. Higher levels of IL-8, PSGL-1, plasminogen, and PAI-1 and intensified fibrinolysis were detected in the intact samples. However, PMA-induced NETosis did not result in an increase in the degree of activation and significant changes in the given parameters.

Conclusion

Conclusion. NETosis promotes both formation and lysis of fibrin clots. However, in cancer patients, suicidal NETosis does not contribute to fibrinolysis due to intracellular protease depletion, which may be one of the mechanisms causing hypercoagulation and insufficient fibrinolysis in cancer. 

ракнейтрофильные внеклеточные ловушкифибринолизиммунотромбознетозгиперкоагуляция.cancerneutrophil extracellular trapsfibrinolysisimmunothrombosisNETosishypercoagulationИсследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (проект № 19-34-90050).ReferencesBrinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004; 303 (5663): 1532–1535. DOI: 10.1126/science.1092385.Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004; 303 (5663): 1532–1535. DOI: 10.1126/science.1092385.Fuchs T.A., Brill A., Duerschmied D., Schatzberg D., Monestier M., Myers D.D. Jr., Wrobleski S.K., Wakefield T.W., Hartwig J.H., Wagner D.D. Extracellular DNA traps promote thrombosis. PNAS. 2010; 107 (36): 15880–15888. DOI: 10.1073/pnas.1005743107.Fuchs T.A., Brill A., Duerschmied D., Schatzberg D., Monestier M., Myers D.D. Jr., Wrobleski S.K., Wakefield T.W., Hartwig J.H., Wagner D.D. Extracellular DNA traps promote thrombosis. PNAS. 2010; 107 (36): 15880–15888. DOI: 10.1073/pnas.1005743107.Martinod K., Demers M., Fuchs T.A., Wong S.L., Brill A., Gallant M., Hu J., Wang Y., Wagner D.D. Neutrophil histone modification by peptidylarginine deiminase 4 is critical for deep vein thrombosis in mice. PNAS. 2013; 110 (21): 8674– 8679. DOI: 10.1073/pnas.1301059110.Martinod K., Demers M., Fuchs T.A., Wong S.L., Brill A., Gallant M., Hu J., Wang Y., Wagner D.D. Neutrophil histone modification by peptidylarginine deiminase 4 is critical for deep vein thrombosis in mice. PNAS. 2013; 110 (21): 8674– 8679. DOI: 10.1073/pnas.1301059110.Czaikoski P.G., Mota J. M.S.C., Nascimento D.C., Sônego F., Castanheira F.V.e S., Melo P.H., Scortegagna G.T., Silva R.L., Barroso-Sousa R., Souto F.O., Pazin-Filho A., Figueiredo F., Alves-Filho J.C., Cunha F.Q. Neutrophil extracellular traps induce organ damage during experimental and clinical sepsis. PLoS One. 2016; 11 (2): e148142. DOI: 10.1371/journal.pone.0148142.Czaikoski P.G., Mota J. M.S.C., Nascimento D.C., Sônego F., Castanheira F.V.e S., Melo P.H., Scortegagna G.T., Silva R.L., Barroso-Sousa R., Souto F.O., Pazin-Filho A., Figueiredo F., Alves-Filho J.C., Cunha F.Q. Neutrophil extracellular traps induce organ damage during experimental and clinical sepsis. PLoS One. 2016; 11 (2): e148142. DOI: 10.1371/journal.pone.0148142.Budnik I., Brill A. Immune factors in deep vein thrombosis initiation. Trends in Immunology. 2018; 39 (8): 610–623. DOI: 10.1016/j.it.2018.04.010.Budnik I., Brill A. Immune factors in deep vein thrombosis initiation. Trends in Immunology. 2018; 39 (8): 610–623. DOI: 10.1016/j.it.2018.04.010.Grover S.P., Mackman N. Neutrophils, NETs, and immunothrombosis. Blood. 2018; 132 (13): 1360–1361. DOI: 10.1182/blood-2018-08-868067.Grover S.P., Mackman N. Neutrophils, NETs, and immunothrombosis. Blood. 2018; 132 (13): 1360–1361. DOI: 10.1182/blood-2018-08-868067.Iba T., Hashiguchi N., Nagaoka I., Tabe Y., Murai M. Neutrophil cell death in response to infection and its relation to coagulation. Journal of Intensive Care. 2013; 1 (1): 13. DOI: 10.1186/2052-0492-1-13. 8. Федоткина Ю.А., Панченко Е.П. Тромбозы в онкологии. Часть 1. Атеротромбоз. 2017; 1: 11–15. DOI: 10.21518/2307-1109-2017-1-11-15.Iba T., Hashiguchi N., Nagaoka I., Tabe Y., Murai M. Neutrophil cell death in response to infection and its relation to coagulation. Journal of Intensive Care. 2013; 1 (1): 13. DOI: 10.1186/2052-0492-1-13. 8. Федоткина Ю.А., Панченко Е.П. Тромбозы в онкологии. Часть 1. Атеротромбоз. 2017; 1: 11–15. DOI: 10.21518/2307-1109-2017-1-11-15.Falanga A., Schieppati F., Russo L. Pathophysiology 1. Mechanisms of thrombosis in cancer patients. In: Soff G. (eds) Thrombosis and hemostasis in cancer. Cancer Treatment and Research. 2019; 179: 11–36. DOI: 10.1007/978-3-030-20315-3_2.Falanga A., Schieppati F., Russo L. Pathophysiology 1. Mechanisms of thrombosis in cancer patients. In: Soff G. (eds) Thrombosis and hemostasis in cancer. Cancer Treatment and Research. 2019; 179: 11–36. DOI: 10.1007/978-3-030-20315-3_2.Chennakrishnaiah S., Meehan B., D’Ast E., Montermini L., Lee T.H., Karatzas N., Buchanan M., Tawil N., Choi D., Divangahi M., Basik M., Rak J. Leukocytes as a reservoir of circulating oncogenic DNA and regulatory targets of tumor‐ derived extracellular vesicles. J. Thromb. Haemost. 2018; 16 (9): 1800–1813. DOI: 10.1111/jth.14222.Chennakrishnaiah S., Meehan B., D’Ast E., Montermini L., Lee T.H., Karatzas N., Buchanan M., Tawil N., Choi D., Divangahi M., Basik M., Rak J. Leukocytes as a reservoir of circulating oncogenic DNA and regulatory targets of tumor‐ derived extracellular vesicles. J. Thromb. Haemost. 2018; 16 (9): 1800–1813. DOI: 10.1111/jth.14222.Таширева Л.А., Перельмутер В.М., Манских В.Н., Денисов Е.В. Савельева О.Е., Кайгородова Е.В., Завьялова М.В. Типы иммуновоспалительных реакций как алгоритмы взаимодействия клеток в условиях репаративной регенерации и опухолевого роста. Биохимия. 2017; 82 (5): 732–748.Таширева Л.А., Перельмутер В.М., Манских В.Н., Денисов Е.В. Савельева О.Е., Кайгородова Е.В., Завьялова М.В. Типы иммуновоспалительных реакций как алгоритмы взаимодействия клеток в условиях репаративной регенерации и опухолевого роста. Биохимия. 2017; 82 (5): 732–748.Demers M., Wong S.L., Martinod K., Gallant M., Cabral E., Wang Y., Wagner D.D. Priming of neutrophils toward netosis promotes tumor growth. Oncoimmunology. 2016; 5 (5): e1134073. DOI: 10.1080/2162402X.2015.1134073.Demers M., Wong S.L., Martinod K., Gallant M., Cabral E., Wang Y., Wagner D.D. Priming of neutrophils toward netosis promotes tumor growth. Oncoimmunology. 2016; 5 (5): e1134073. DOI: 10.1080/2162402X.2015.1134073.Shaul M.E., Fridlender Z.G. Cancer-related circulating and tumor-associated neutrophils –subtypes, sources and function. FEBS J. 2018; 285 (23): 4316–4342. DOI: 10.1111/ febs.14524.Shaul M.E., Fridlender Z.G. Cancer-related circulating and tumor-associated neutrophils –subtypes, sources and function. FEBS J. 2018; 285 (23): 4316–4342. DOI: 10.1111/ febs.14524.Leal A.C., Mizurini D.M., Gomes T., Rochael N.C., Saraiva E.M., Dias M.S., Werneck C.C., Sielski M.S., Vicente C.P., Monteiro R.Q. Tumor-derived exosomes induce the formation of neutrophil traps: Implications for the establishment of cancer-associated thrombosis. Sci. Rep. 2017; 7 (1): 6438. DOI: 10.1038/s41598-017-06893-7.Leal A.C., Mizurini D.M., Gomes T., Rochael N.C., Saraiva E.M., Dias M.S., Werneck C.C., Sielski M.S., Vicente C.P., Monteiro R.Q. Tumor-derived exosomes induce the formation of neutrophil traps: Implications for the establishment of cancer-associated thrombosis. Sci. Rep. 2017; 7 (1): 6438. DOI: 10.1038/s41598-017-06893-7.Thiam H.R., Wong S.L., Wagner D.D., Waterman C.M. Cellular Mechanisms of NETosis Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2020; 36: 191–218. DOI: 10.1146/annurev-cellbio-020520-111016.Thiam H.R., Wong S.L., Wagner D.D., Waterman C.M. Cellular Mechanisms of NETosis Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2020; 36: 191–218. DOI: 10.1146/annurev-cellbio-020520-111016.Паршина А.А., Цыбиков Н.Н. Влияние нейтрофильных внеклеточных ловушек на коагуляционный гемостаз и фибринолиз у пациентов со злокачественными новообразованиями толстого кишечника. Забайкальский медицинский вестник. 2019; 4: 90–96.Паршина А.А., Цыбиков Н.Н. Влияние нейтрофильных внеклеточных ловушек на коагуляционный гемостаз и фибринолиз у пациентов со злокачественными новообразованиями толстого кишечника. Забайкальский медицинский вестник. 2019; 4: 90–96.Damiana T., Damgaard D., Sidelmann J.J., Nielsen C.H., de Maat M.P., Münster A.M.B., Palarasah Y. Citrullination of fibrinogen by peptidylarginine deiminase 2 impairs fibrin clot structure. Clinica Chimica Acta. 2020; 501: 6–11. DOI: 10.1016/j.cca.2019.10.033.Damiana T., Damgaard D., Sidelmann J.J., Nielsen C.H., de Maat M.P., Münster A.M.B., Palarasah Y. Citrullination of fibrinogen by peptidylarginine deiminase 2 impairs fibrin clot structure. Clinica Chimica Acta. 2020; 501: 6–11. DOI: 10.1016/j.cca.2019.10.033.Zhou Y., Chen B., Mittereder N., Chaerkady R., Strain M., An. L.-L., Rahman S., Ma W., Low C.P., Chan D., Neal F., Bingham III C.O., Sampson K., Darrah E., Siegel M.R., Hasni S., Andrade F., Vousden K.A., Mustelin T., Sims G.P. Spontaneous secretion of the citrullination enzyme PAD2 and cell surface exposure of PAD4 by neutrophils. Frontiers in Immunology. 2017; 8: 1200. DOI: 10.3389/fimmu.2017.01200.Zhou Y., Chen B., Mittereder N., Chaerkady R., Strain M., An. L.-L., Rahman S., Ma W., Low C.P., Chan D., Neal F., Bingham III C.O., Sampson K., Darrah E., Siegel M.R., Hasni S., Andrade F., Vousden K.A., Mustelin T., Sims G.P. Spontaneous secretion of the citrullination enzyme PAD2 and cell surface exposure of PAD4 by neutrophils. Frontiers in Immunology. 2017; 8: 1200. DOI: 10.3389/fimmu.2017.01200.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.