ssmuБюллетень сибирской медициныBulletin of Siberian Medicine1682-03631819-3684Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation10.20538/1682-0363-2024-2-183-189ssmu-5675Research ArticleСЛУЧАЙ ИЗ КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИCLINICAL CASESФункциональный анализ новой мутации сплайсинга c.2067+2T>G в гене MYBPC3 при гипертрофической кардиомиопатииFunctional analysis of a new splicing mutation in the MYBPC3 gene in hypertrophic cardiomyopathyhttps://orcid.org/0000-0002-9789-9555СалаховР. Р.SalakhovR. R.

Салахов Рамиль Ринатович – канд. мед. наук, науч. сотрудник, лаборатория популяционной генетики 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10

10, Ushayka Embankment, Tomsk, 634050

ramil.salakhov@medgenetics.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7692-9954ГолубенкоМ. В.GolubenkoM. V.

Голубенко Мария Владимировна – канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория популяционной генетики 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10

10, Ushayka Embankment, Tomsk, 634050

maria-golubenko@medgenetics.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7293-3438СкобловМ. Ю.SkoblovM. Y.

Скоблов Михаил Юрьевич – канд. биол. наук, зав. лабораторией функциональной геномики 

115522, г. Москва, ул. Москворечье, 1

1, Moskvorechye Str., Moscow 115522

mskoblov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3839-3543СавченкоР.SavchenkoR. R.

Савченко Рената – канд. биол. наук, науч. сотрудник, лаборатория геномики орфанных болезней 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10

10, Ushayka Embankment, Tomsk, 634050

renata.savchenko@medgenetics.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7969-7020ВалиахметовН. Р.ValiakhmetovN. R.

Валиахметов Наиль Раушанович – мл. науч. сотрудник, лаборатория геномики орфанных болезней 

634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10

10, Ushayka Embankment, Tomsk, 634050

valiakhmetov.nail@medgenetics.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3081-9477ПавлюковаЕ. Н.PavlyukovaE. N.

Павлюкова Елена Николаевна – д-р мед. наук, профессор, зав. отделением атеросклероза и хронической ишемической болезни сердца 

634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а

111a, Kievskaya Str., Tomsk, 634012

pavluk@cardio-tomsk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0673-4094НазаренкоМ. С.NazarenkoM. S.

Назаренко Мария Сергеевна – д-р мед. наук, руководитель лаборатории популяционной генетики 

634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а

10, Ushayka Embankment, Tomsk, 634050

maria.nazarenko@medgenetics.ruНаучно-исследовательский институт медицинской генетики (НИИ МГ), Томский национальный исследовательский медицинский центр (НИМЦ) Российской академии наукРоссияResearch Institute of Medical Genetics, Tomsk National Research Medical Center (NRMC), Russian Academy of SciencesRussian FederationМедико-генетический научный центр (МГНЦ) им. акад. Н.П. БочковаРоссияResearch Center of Medical GeneticsRussian FederationНаучно-исследовательский институт (НИИ) кардиологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр (НИМЦ) Российской академии наукРоссияCardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center (NRMC), Russian Academy of SciencesRussian FederationНаучно-исследовательский институт (НИИ) кардиологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр (НИМЦ) Российской академии наукРоссияResearch Institute of Medical Genetics, Tomsk National Research Medical Center (NRMC), Russian Academy of SciencesRussian Federation202411072024232183189Copyright © Салахов Р.Р., Голубенко М.В., Скоблов М.Ю., Савченко Р.R., Валиахметов Н.Р., Павлюкова Е.Н., Назаренко М.С., 20242024Салахов Р.Р., Голубенко М.В., Скоблов М.Ю., Савченко Р., Валиахметов Н.Р., Павлюкова Е.Н., Назаренко М.С.Salakhov R.R., Golubenko M.V., Skoblov M.Y., Savchenko R.R., Valiakhmetov N.R., Pavlyukova E.N., Nazarenko M.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/5675

Цель – исследование патогенного эффекта варианта в сайте сплайсинга MYBPC3 у пациента с гипертрофической кардиомиопатией. Материалы и методы. Исследование проведено с использованием образца ДНК пациентки с гипертрофической кардиомиопатией, у которой был выявлен ранее не описанный вариант в донорном сайте сплайсинга интрона 21. Применены методы конструирования и клонирования мини-генов (вектор pSpl3- Flu2-TKdel), трансфекции культуры клеток человека (HEK293T), с последующим выделением мРНК, получением кДНК, ПЦР участка мини-гена, содержащего анализируемый фрагмент, электрофореза в агарозном геле, секвенирования по Сэнгеру. Результаты. Вариант chr11:47339649-A-C (hg38), нарушающий донорный сайт сплайсинга в интроне 21 (NM_000256.3: c.2067+2T>G), был выявлен у пациентки 23 лет с обструктивной формой гипертрофической кардиомиопатии. Для прямого анализа влияния этого варианта на сплайсинг был получен вектор, содержащий экзон 21, интрон 21, экзон 22, частично интроны 20 и 22 MYBPC3. Сравнение мРНК, полученных для мини-генов, содержащих или несодержащих исследуемый вариант, показало, что замена chr11:47339649-A-C приводит к пропуску экзонов 21 и 22 в процессе сплайсинга. Заключение. В результате исследования установлена функциональная значимость ранее не описанного варианта c.2067+2T>G в гене MYBPC3, приводящего к нарушению механизма сплайсинга мРНК у пациента с гипертрофической кардиомиопатией. Данный вариант может быть классифицирован как патогенный.

Aim. To study the pathogenic effect in the MYBPC3 splice-site variant in the patient with hypertrophic cardiomyopathy. Materials and methods. The study was conducted using a DNA sample obtained from a patient with hypertrophic cardiomyopathy, in whom a previously undescribed variant was identified in the splice donor site of intron 21. The methods used included constructing and cloning of minigenes (vector pSpl3-Flu2-TKdel) and transfection of a human cell culture (HEK293T), followed by isolation of mRNA, production of cDNA, PCR of the minigene region containing the analyzed fragment, agarose gel electrophoresis, and Sanger sequencing. Results. The chr11:47339649-A-C (hg38) variant, disrupting the splice donor site in intron 21 (NM_000256.3: c.2067+2T>G), was identified in the 23-year-old patient with obstructive hypertrophic cardiomyopathy. To directly analyze the effect of this variant on splicing, a vector containing exon 21, intron 21, exon 22, and partially introns 20 and 22 of the MYBPC3 gene was obtained. A comparison of mRNAs from the minigenes containing / not containing the variant showed that the chr11:47339649-A-C substitution led to exon 21 and exon 22 skipping during splicing. Conclusion. The study established the functional significance of the previously undescribed variant c.2067+2T>G in the MYBPC3 gene, resulting in disruption of the mRNA splicing mechanism in the patient with hypertrophic cardiomyopathy. This variant can be classified as pathogenic.

гипертрофическая кардиомиопатияMYBPC3мини-генысплайсингhypertrophic cardiomyopathyMYBPC3minigenesplicingИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-24- 01164, https://rscf.ru/project/22-24-01164/The study was supported by the Russian Science Foundation Grant No. 22-24-01164, https:// rscf.ru/project/22-24-01164/ReferencesMaron B.J., Towbin J.A., Thiene G., Antzelevitch C., Corrado D., Arnett D. et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation. 2006;113(14):1807–1816. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.174287.Maron B.J., Towbin J.A., Thiene G., Antzelevitch C., Corrado D., Arnett D. et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation. 2006;113(14):1807–1816. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.174287.Semsarian C., Ingles J., Maron M.S., Maron B.J. New perspectives on the prevalence of hypertrophic cardiomyopathy. J. Am. Coll. Cardiol. 2015;65(12):1249–1254. DOI: 10.1016/j.jacc.2015.01.019Semsarian C., Ingles J., Maron M.S., Maron B.J. New perspectives on the prevalence of hypertrophic cardiomyopathy. J. Am. Coll. Cardiol. 2015;65(12):1249–1254. DOI: 10.1016/j.jacc.2015.01.019Ingles .J, Goldstein J., Thaxton C., Caleshu C., Corty E.W., Crowley S.B. et al. Evaluating the Clinical validity of hypertrophic cardiomyopathy genes. Circ. Genom. Precis. Med. 2019;12(2):e002460. DOI: 10.1161/CIRCGEN.119.002460.Ingles .J, Goldstein J., Thaxton C., Caleshu C., Corty E.W., Crowley S.B. et al. Evaluating the Clinical validity of hypertrophic cardiomyopathy genes. Circ. Genom. Precis. Med. 2019;12(2):e002460. DOI: 10.1161/CIRCGEN.119.002460.Carrier L. Targeting the population for gene therapy with MYBPC3. J. Mol. Cell Cardiol. 2021;150:101–108. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2020.10.003.Carrier L. Targeting the population for gene therapy with MYBPC3. J. Mol. Cell Cardiol. 2021;150:101–108. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2020.10.003.Behrens-Gawlik V., Mearini G., Gedicke-Hornung C., Richard P., Carrier L. MYBPC3 in hypertrophic cardiomyopathy: from mutation identification to RNA-based correction. Pflugers Arch. 2014;466(2):215–223. DOI: 10.1007/s00424-013-1409-7.Behrens-Gawlik V., Mearini G., Gedicke-Hornung C., Richard P., Carrier L. MYBPC3 in hypertrophic cardiomyopathy: from mutation identification to RNA-based correction. Pflugers Arch. 2014;466(2):215–223. DOI: 10.1007/s00424-013-1409-7.Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet. Med. 2015;17(5):405–424. DOI: 10.1038/gim.2015.30.Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet. Med. 2015;17(5):405–424. DOI: 10.1038/gim.2015.30.Gaildrat P., Killian A., Martins A., Tournier I., Frébourg T., Tosi M. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods Mol. Biol. 2010;653:249–257. DOI: 10.1007/978-1-60761-759-4_15.Gaildrat P., Killian A., Martins A., Tournier I., Frébourg T., Tosi M. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods Mol. Biol. 2010;653:249–257. DOI: 10.1007/978-1-60761-759-4_15.Desviat L.R., Pérez B., Ugarte M. Minigenes to confirm exon skipping mutations. Methods Mol. Biol. 2012;867:37–47. DOI: 10.1007/978-1-61779-767-5_3.Desviat L.R., Pérez B., Ugarte M. Minigenes to confirm exon skipping mutations. Methods Mol. Biol. 2012;867:37–47. DOI: 10.1007/978-1-61779-767-5_3.Kopanos C., Tsiolkas V., Kouris A., Chapple C.E., Albarca Aguilera M., Meyer R. et al. Var Some: the human genomic variant search engine. Bioinformatics. 2019;35(11):1978–1980. DOI: 10.1093/bioinformatics/bty897.Kopanos C., Tsiolkas V., Kouris A., Chapple C.E., Albarca Aguilera M., Meyer R. et al. Var Some: the human genomic variant search engine. Bioinformatics. 2019;35(11):1978–1980. DOI: 10.1093/bioinformatics/bty897.Filatova A.Y., Vasilyeva T.A., Marakhonov A.V., Voskresenskaya A.A., Zinchenko R.A., Skoblov M.Y. Functional reassessment of PAX6 single nucleotide variants by in vitro splicing assay. Eur. J. Hum. Genet. 2019;27(3):488–493. DOI: 10.1038/s41431-018-0288-y.Filatova A.Y., Vasilyeva T.A., Marakhonov A.V., Voskresenskaya A.A., Zinchenko R.A., Skoblov M.Y. Functional reassessment of PAX6 single nucleotide variants by in vitro splicing assay. Eur. J. Hum. Genet. 2019;27(3):488–493. DOI: 10.1038/s41431-018-0288-y.Shenasa H., Hertel K.J. Combinatorial regulation of alternative splicing. Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech. 2019;1862(11–12):194392. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2019.06.003.Shenasa H., Hertel K.J. Combinatorial regulation of alternative splicing. Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech. 2019;1862(11–12):194392. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2019.06.003.Baralle D., Baralle M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. J. Med. Genet. 2005;42(10):737–748. DOI: 10.1136/jmg.2004.029538.Baralle D., Baralle M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. J. Med. Genet. 2005;42(10):737–748. DOI: 10.1136/jmg.2004.029538.Suay-Corredera C., Pricolo M.R., Herrero-Galán E., Velázquez-Carreras D., Sánchez-Ortiz D., García-Giustiniani D. et al. Protein haploinsufficiency drivers identify MYBPC3 variants that cause hypertrophic cardiomyopathy. J. Biol. Chem. 2021;297(1):100854. DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100854.Suay-Corredera C., Pricolo M.R., Herrero-Galán E., Velázquez-Carreras D., Sánchez-Ortiz D., García-Giustiniani D. et al. Protein haploinsufficiency drivers identify MYBPC3 variants that cause hypertrophic cardiomyopathy. J. Biol. Chem. 2021;297(1):100854. DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100854.Helms A.S., Tang V.T., O’Leary T.S., Friedline S., Wauchope M., Arora A. et al. Effects of MYBPC3 loss-of-function mutations preceding hypertrophic cardiomyopathy. JCI Insight. 2020;5(2):e133782. DOI: 10.1172/jci.insight.133782.Helms A.S., Tang V.T., O’Leary T.S., Friedline S., Wauchope M., Arora A. et al. Effects of MYBPC3 loss-of-function mutations preceding hypertrophic cardiomyopathy. JCI Insight. 2020;5(2):e133782. DOI: 10.1172/jci.insight.133782.Seeger T., Shrestha R., Lam C.K., Chen C., McKeithan W.L., Lau E. et al. A Premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 2019;139(6):799–811. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034624.Seeger T., Shrestha R., Lam C.K., Chen C., McKeithan W.L., Lau E. et al. A Premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 2019;139(6):799–811. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034624.Singer E.S., Ingles J., Semsarian C., Bagnall R.D. Key Value of RNA analysis of MYBPC3 splice-site variants in hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom Precis. Med. 2019;12(1):e002368. DOI: 10.1161/CIRCGEN.118.002368.Singer E.S., Ingles J., Semsarian C., Bagnall R.D. Key Value of RNA analysis of MYBPC3 splice-site variants in hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom Precis. Med. 2019;12(1):e002368. DOI: 10.1161/CIRCGEN.118.002368.Lopes L.R., Barbosa P., Torrado M., Quinn E., Merino A., Ochoa J.P. et al. Cryptic splice-altering variants in MYBPC3 are a prevalent cause of hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom. Precis. Med. 2020;13(3):e002905. DOI: 10.1161/CIRCGEN.120.002905.Lopes L.R., Barbosa P., Torrado M., Quinn E., Merino A., Ochoa J.P. et al. Cryptic splice-altering variants in MYBPC3 are a prevalent cause of hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom. Precis. Med. 2020;13(3):e002905. DOI: 10.1161/CIRCGEN.120.002905.Torrado M., Maneiro E., Lamounier Junior A., FernándezBurriel M., Sánchez Giralt S., Martínez-Carapeto A. et al. Identification of an elusive spliceogenic MYBPC3 variant in an otherwise genotype-negative hypertrophic cardiomyopathy pedigree. Sci. Rep. 2022;12(1):7284. DOI: 10.1038/s41598-022-11159-y.Torrado M., Maneiro E., Lamounier Junior A., FernándezBurriel M., Sánchez Giralt S., Martínez-Carapeto A. et al. Identification of an elusive spliceogenic MYBPC3 variant in an otherwise genotype-negative hypertrophic cardiomyopathy pedigree. Sci. Rep. 2022;12(1):7284. DOI: 10.1038/s41598-022-11159-y.GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369(6509):1318–1330. DOI: 10.1126/science.aaz1776.GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369(6509):1318–1330. DOI: 10.1126/science.aaz1776.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.