ssmuБюллетень сибирской медициныBulletin of Siberian Medicine1682-03631819-3684Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation10.20538/1682-0363-2025-1-134-140ssmu-5972Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL PAPERSЭффективность двух доступных наборов для амплификации трех нуклеотидных полиморфизмов, содержащих GC-богатые участки: 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) и -216G/T (rs712829), у больных немелкоклеточным раком легкогоEfficiency of two available kits for amplification of three EGFR SNPs in patients with NSCLC: 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) and -216G/T (rs712829) with GC-rich regionshttps://orcid.org/0000-0001-6525-128XЮришичВ.JurišićV.

Юришич Владимир – д-р мед. наук, профессор, факультет медицинских наук 

34000, г. Крагуевац, ул. Светозара Марковича, 69

69, Svetozar Markovic Str., Kragujevac, 34000

jurisicvladimir@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8853-6525ОбрадовичЯ.ObradovićJ.

Обрадович Ясмина – д-р биол. наук, науч. сотрудник, отдел естественных наук 

34000, г. Крагуевац, ул. Радоя Домановича, 12

12, Radoja Domanovicha Str., Kragujevac, 34000

https://orcid.org/0000-0002-2915-1641ПавловичС.PavlovićS.

Павлович Соня – д-р биол. наук, профессор 

11000, г. Белград, ул. Студенческий пр., 1

1, Student Ave., Belgrade, 11000

sonya@sezampro.rshttps://orcid.org/0000-0002-1293-6215ТошичН.TošićN.

Тошич Наташа – д-р биол. наук, науч. сотрудник в области биологии 

11000, г. Белград, ул. Студенческий пр., 1

1, Student Ave., Belgrade, 11000

natasa.tosic@imgge.bg.ac.rshttps://orcid.org/0000-0002-7693-3777ГуляеваЛ. Ф.GulaevaL. F.

Гуляева Людмила Федоровна – д-р биол. наук, профессор, вед. науч. сотрудник 

630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

52, Krasny Av., Novosibirsk, 630091

lfgulyaeva@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3321-801XГерштейнЕ. С.GershteinE. S.

Герштейн Елена Сергеевна – д-р мед. наук, профессор, вед. науч. сотрудник, лаборатория клинико-диагностической консультативно-диагностического центра 

115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

24, Kashirskoye highway, Moscow, 115522

esgershtein@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3898-4127КушлинскийН. Е.KushlinskiiN. E.

Кушлинский Николай Евгеньевич – д-р мед. наук, профессор, академик РАН, науч. руководитель лаборатории клинико-диагностической консультативно-диагностического центра 

115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

24, Kashirskoye highway, Moscow, 115522

biochimia@yandex.ruКрагуевацкий университетСербияFaculty of Medical Sciences, Unversity of KragujevacSerbiaИнститут биологии и экологии, Крагуевацкий университетСербияInstitute of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of KragujevacSerbiaИнститут молекулярной генетики и генной инженерии, Белградский университетСербияInstitute of Molecular Genetics and Genetic Engineering, University of BelgradeSerbiaФедеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины (ФИЦ ФТМ)РоссияUniversity of MedicineRussian FederationНациональный медицинский исследовательский центр (НМИЦ) онкологии им. Н.Н. БлохинаРоссияN.N. Blokhin National Medical Research Center of OncologyRussian Federation202516042025241134140Copyright © Юришич В., Обрадович Я., Павлович С., Тошич Н., Гуляева Л.Ф., Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 20252025Юришич В., Обрадович Я., Павлович С., Тошич Н., Гуляева Л.Ф., Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е.Jurišić V., Obradović J., Pavlović S., Tošić N., Gulaeva L.F., Gershtein E.S., Kushlinskii N.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/5972

Цель исследования – сравнительный анализ двух доступных наборов, содержащих в одной реакционной смеси все реагенты и добавки, включая 100 mM Tris-НCl, 100 mM KCL, 4 mM MgSO4, 0,2% of Tween 20, необходимых для амплификации трех наиболее часто встречающихся у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) полиморфизмов гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR: 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) и -216G/T (rs712829). Материалы и методы. Протокол для генотипирования 181946C>T, 191C>A и -216G/T был уточнен в соответствии с ранее представленными данными. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) размером 197 bp детектировали с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле с последующим окрашиванием этидиум бромидом. Результаты. Наборы реактивов Biomaster HS Taq-PCR Color 2× и Biomaster LR HS PCR 2× были эффективны для амплификации 181946 G/A, локализованной в интроне гена EGFR. Кроме того, полиморфизмы -191 C/A (rs712829) и -216G/T (rs712829), расположенные в промоторном участке и содержащие чрезвычайно высокое количество GC, успешно амплифицировались с помощью набора Biomaster LR HS PCR 2×. Заключение. В настоящем исследовании показано, что наборы реактивов Biomaster HS Taq-PCR Color 2× и Biomaster LR HS PCR 2× эффективны для амплификации 181946 G/A, локализованного в интроне гена EGFR. Кроме того, EGFR SNP -191 C/A, локализованный в промоторном участке с крайне высоким содержанием GC-пар, успешно амплифицировался с помощью набора реактивов Biomaster LR HS PCR 2x.

Aim. To conduct a comparative analysis of two available kits that contain all necessary reagents and additives in a single reaction mixture, including 100 mM Tris-НCl, 100 mM KCL, 4 mM MgSO4, 0.2% of Tween 20, for the amplification of the three most common EGFR (epidermal growth factor receptor) gene polymorphisms in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC): 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) and -216G/T (rs712829). Materials and methods. The protocol for genotyping 181946C>T, 191C>A and -216G/T was refined according to previously reported data. Polymerase chain reaction (PCR) products measuring 197 bp were detected using electrophoresis in a 2% agarose gel, followed by staining with ethidium bromide. Results. The Biomaster HS Taq-PCR Color 2× and Biomaster LR HS PCR 2× reagent kits were effective for amplification of 181946 G/A polymorphism located in the intron of the EGFR gene. Additionally, polymorphisms -191 C/A (rs712829) and -216G/T (rs712829), located in the promoter region and containing a high GC content, were successfully amplified using the Biomaster LR HS PCR 2× kit. Conclusion. The present study shows that the Biomaster HS Taq-PCR Color 2× and Biomaster LR HS PCR 2× reagent kits are effective for amplification of 181946 G/A polymorphism located in the intron of the EGFR gene. Furthermore, the EGFR SNP -191 C/A, located in the promoter region with a high GC content, was successfully amplified using the Biomaster LR HS PCR 2× reagent kit. 

добавкиамплификацияEGFRНМРЛполиморфизмПЦРреагентыadditivesamplificationEGFRNSCLCpolymorphismPCRreagentsЭта работа частично поддерживалась Министерством образования, науки и технологического развития Республики Сербия (№ 451-03-137/2025-03/200111, 451-03-136/2025- 03/200378).This study was partially supported by the Ministry of Education, Science and Technological Development of the Republic of Serbia.ReferencesLiu W., Innocenti F., Wu M.H., Desai A.A., Dolan M.E., Cook E.H. et al. A functional common polymorphism in a Sp1 recognition site of the epidermal growth factor receptor gene promoter. Cancer Res. 2005;65(1):46–53. PMID: 15665278.Liu W., Innocenti F., Wu M.H., Desai A.A., Dolan M.E., Cook E.H. et al. A functional common polymorphism in a Sp1 recognition site of the epidermal growth factor receptor gene promoter. Cancer Res. 2005;65(1):46–53. PMID: 15665278.Nomura M., Shigematsu H., Li L., Suzuki M., Takahashi T., Estess P. et al. Polymorphisms, mutations, and amplification of the egfr gene in non-small cell lung cancers. PLoS Med. 2007;4(4):e125. DOI: 10.1371/journal.pmed.0040125.Nomura M., Shigematsu H., Li L., Suzuki M., Takahashi T., Estess P. et al. Polymorphisms, mutations, and amplification of the egfr gene in non-small cell lung cancers. PLoS Med. 2007;4(4):e125. DOI: 10.1371/journal.pmed.0040125.Obradović J., Djordjević N., Tošić N., Mrdjanović J., Stanković B., Stanić J. et al. Frequencies of EGFR single nucleotide polymorphisms in non-small cell lung cancer patients and healthy individuals in the Republic of Serbia: a preliminary study. Tumor Biol. 2016;37(8):10479–10486. DOI: 10.1007/s13277-016-4930-4.Obradović J., Djordjević N., Tošić N., Mrdjanović J., Stanković B., Stanić J. et al. Frequencies of EGFR single nucleotide polymorphisms in non-small cell lung cancer patients and healthy individuals in the Republic of Serbia: a preliminary study. Tumor Biol. 2016;37(8):10479–10486. DOI: 10.1007/s13277-016-4930-4.Ma F., Sun T., Shi Y., Yu D., Tan W., Yang M. et al. Polymorphisms of EGFR predict clinical outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Lung Cancer. 2009;66(1):114–119. DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.12.025.Ma F., Sun T., Shi Y., Yu D., Tan W., Yang M. et al. Polymorphisms of EGFR predict clinical outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Lung Cancer. 2009;66(1):114–119. DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.12.025.Obradovic J., Jurisic V., Tosic N., Mrdjanovic J., Perin B., Pavlovic S. et al. Optimization of PCR conditions for amplification of GC-Rich EGFR promoter sequence. J. Clin. Lab. Anal. 2013;27(6):487–493. DOI: 10.1002/jcla.21632.Obradovic J., Jurisic V., Tosic N., Mrdjanovic J., Perin B., Pavlovic S. et al. Optimization of PCR conditions for amplification of GC-Rich EGFR promoter sequence. J. Clin. Lab. Anal. 2013;27(6):487–493. DOI: 10.1002/jcla.21632.Hubé F., Reverdiau P., Iochmann S., Gruel Y. Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences. Mol. Biotechnol. 2005;31(1):81–84. DOI: 10.1385/MB:31:1:081.Hubé F., Reverdiau P., Iochmann S., Gruel Y. Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences. Mol. Biotechnol. 2005;31(1):81–84. DOI: 10.1385/MB:31:1:081.Jensen M.A., Fukushima M., Davis R.W. DMSO and betaine greatly improve amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS One. 2010;5(6):e11024. DOI: 10.1371/journal.pone.0011024.Jensen M.A., Fukushima M., Davis R.W. DMSO and betaine greatly improve amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS One. 2010;5(6):e11024. DOI: 10.1371/journal.pone.0011024.Strien J., Sanft J., Mall G. Enhancement of PCR Amplification of moderate GC-containing and highly GC-rich DNA Sequences. Mol. Biotechnol. 2013;54(3):1048–1054. DOI: 10.1007/s12033-013-9660-x.Strien J., Sanft J., Mall G. Enhancement of PCR Amplification of moderate GC-containing and highly GC-rich DNA Sequences. Mol. Biotechnol. 2013;54(3):1048–1054. DOI: 10.1007/s12033-013-9660-x.Jurišić V., Obradović J., Tošić N., Pavlović S., Kulić M., Djordjević N. Effects of DMSO, glycerol, betaine and their combinations in detecting single nucleotide polymorphisms of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene promoter sequence in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016;128:275–279. DOI: 10.1016/j.jpba.2016.05.010.Jurišić V., Obradović J., Tošić N., Pavlović S., Kulić M., Djordjević N. Effects of DMSO, glycerol, betaine and their combinations in detecting single nucleotide polymorphisms of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene promoter sequence in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016;128:275–279. DOI: 10.1016/j.jpba.2016.05.010.Lorenz T.C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 2012;(63):e3998. DOI: 10.3791/3998.Lorenz T.C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 2012;(63):e3998. DOI: 10.3791/3998.Sahdev S., Saini S., Tiwari P., Saxena S., Singh Saini K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol. Cell Probes. 2007;21(4):303–307. DOI: 10.1016/j.mcp.2007.03.004.Sahdev S., Saini S., Tiwari P., Saxena S., Singh Saini K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol. Cell Probes. 2007;21(4):303–307. DOI: 10.1016/j.mcp.2007.03.004.Naz S., Fatima A. Amplification of GC-rich DNA for high-throughput family based genetic studies. Mol. Biotechnol. 2013;53(3):345–350. DOI: 10.1007/s12033-012-9559-y.Naz S., Fatima A. Amplification of GC-rich DNA for high-throughput family based genetic studies. Mol. Biotechnol. 2013;53(3):345–350. DOI: 10.1007/s12033-012-9559-y.Wei M., Deng J., Feng K., Yu B., Chen Y. Universal method facilitating the amplification of extremely GC-rich DNA fragments from genomic DNA. Anal. Chem. 2010;82(14):6303–6307. DOI: 10.1021/ac100797t.Wei M., Deng J., Feng K., Yu B., Chen Y. Universal method facilitating the amplification of extremely GC-rich DNA fragments from genomic DNA. Anal. Chem. 2010;82(14):6303–6307. DOI: 10.1021/ac100797t.Bachmann B., Luke W., Hunsmann G. Improvement of PCR amplified DNA sequencing with the aid of detergents. Nucleic Acids Res. 1990;18(5):1309. DOI: 10.1093/nar/18.5.1309.Bachmann B., Luke W., Hunsmann G. Improvement of PCR amplified DNA sequencing with the aid of detergents. Nucleic Acids Res. 1990;18(5):1309. DOI: 10.1093/nar/18.5.1309.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.