Материал и методы

ssmu

Бюллетень сибирской медицины

Bulletin of Siberian Medicine

1682-03631819-3684

Siberian State Medical University, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

10.20538/1682-0363-2016-5-16-29

ssmu-729

Research Article

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ORIGINAL PAPERS

Клеточные реакции на трехмерные матриксы из полимолочной кислоты и гидроксиапатита, полученные методом 3D-печати

Cellular reactions to three-dimensional matrices of polylactic acid and hydroxyapatite generated by 3D-printing

Дружинина

Т. В.

Druzhinina

T. V.

канд. мед. наук,

123182, г. Москва, Щукинская ул., 5/2

PhD, Researcher,

5/2, Schukinskaya Str., Moscow, 123182

Талалаев

С. Я.

Talalaev

S. Ya.

зам. директора по науке,

123182, г. Москва, Щукинская ул., 5/2

Deputy Director for Science,

5/2, Schukinskaya Str., Moscow, 123182

Закиров

Н. П.

Zakirov

N. P.

первый заместитель директора,

123182, г. Москва, Щукинская ул., 5/2

First Deputy Director,

5/2, Schukinskaya Str., Moscow, 123182

Щаденко

С. В.

Shchadenko

S. V.

зав. лабораторией медицинской электроники, 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30

ассистент кафедры промышленной и медицинской электроники, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

Head of Laboratory Medical Eelectronics, 2, Moscow Trakt, Tomsk, 634050;

Assistant, Department of Industrial and Medical Electronics, 30, Lenina Av., Tomsk, 634050

Хабибуллин

Ш. А.

Khabibulin

Sh. A.

канд. техн. наук, инженер центра управления научно-исследовательским обору- дованием,

634050, г. Томск, пр. Ленина, 30

PhD, Engineer Control Center Research Equipment,

30, Lenina Av., Tomsk, 634050

Хлусов

И. А.

Khlusov

I. A.

д-р мед. наук, профессор кафедры морфологии и общей патологии, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2;

профессор кафедры экспериментальной физики, 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30;

директор, 634061, г. Томск, ул. Сибирская, 31

MD, Professor, Department of Morphology and General Pathology, 2, Moscow Trakt, Tomsk, 634050

Department of Experimental Physics, Tomsk Polytechnic University, 30, Lenina Av., Tomsk, 634050;

Head of Bioconstructor-S Ltd., 31, Sibirskaya Str., Tomsk, 634061

khlusov63@mail.ru

Литвинова

Л. С.

Litvinova

L. S.

д-р мед. наук, зав. лабораторией иммунологии и клеточных биотехнологий Инновационного парка Балтийского федерального университета им. И. Канта,

236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14

MD, Нead of Laboratory Immunology and Cell Biotechnologie,

14A, Nevskyi Str., Kaliningrad, 236041

ФГУП «Экспериментально-производственные мастерские» ФМБА РоссииРоссияFederal State Unitary Enterprise “Experimental production workshops”, Federal Medical and Biological AgencyRussian Federation

Сибирский государственный медицинский университет; Национальный исследовательский Томский политехнический университет (НИ ТПУ)РоссияSiberian State Medical University; National Research Tomsk Polytechnic UniversityRussian Federation

Национальный исследовательский Томский политехнический университет (НИ ТПУ)РоссияNational Research Tomsk Polytechnic UniversityRussian Federation

Сибирский государственный медицинский университет; Национальный исследовательский Томский политехнический университет (НИ ТПУ); ООО «Биоконструктор-С»РоссияSiberian State Medical University; National Research Tomsk Polytechnic University; Bioconstructor-S Ltd.Russian Federation

Балтийский федеральный университет имени И. КантаРоссияImmanuel Kant Baltic Federal UniversityRussian Federation

2016

31012017

1551629

2017

Дружинина Т.В., Талалаев С.Я., Закиров Н.П., Щаденко С.В., Хабибуллин Ш.А., Хлусов И.А., Литвинова Л.С.

Druzhinina T.V., Talalaev S.Y., Zakirov N.P., Shchadenko S.V., Khabibulin S.A., Khlusov I.A., Litvinova L.S.

Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://bulletin.ssmu.ru/jour/article/view/729

Цель исследования – оценить ex vivo физико-химические и биологические свойства трехмерных (3D) биодеградируемых матриксов «полимолочная кислота – фосфаты кальция», полученных с помощью аддитивных технологий (3D-печати), как потенциальных материалов для восстановления костной ткани.

Материал и методы

Материал и методы. Экспериментальные образцы (диски толщиной 1,2–1,6 мм и диаметром 8 или 11 мм) композитных биодеградируемых 3D-матриксов (далее – 3D-композиты) получены из исходной смеси 95 мас% полимолочной кислоты (PLA) и 5 мас% гидроксиапатита (НАР) методом компьютер- ного проектирования в программной среде Blender и последующего послойного наплавления нитей (диаметр 1,75 мм) при помощи 3D-принтера. В качестве контроля служили матриксы из 100 мас% PLA. Одна из поверхностей образцов была текстурирована бороздками шириной 0,3–0,5 мм. Изучали физико-химические свойства образцов диаметром 11 мм: геометрию, массу, морфологию, шероховатость, электростатический потенциал и смачиваемость поверхности, элементный состав. Биологические испытания включали изучение 24-часовой цитотоксичности образцов диаметром 8 мм на культуре мононуклеарных лейкоцитов здорового добровольца или лейкозных Т-лимфобластоподобных клеток человека линии Jurkat 5332 (далее Jurkat Т-клетки). В 21-суточной культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) жировой ткани человека определяли остеогенный потенциал образцов диаметром 11 мм по секреции остеокальцина, минерализации межклеточного матрикса, визуализированной окраской ализарином.

Основные результаты

Основные результаты. Характеристики трехмерных биодеградируемых матриксов PLA-HAP, полученных методом 3D-печати, во многом соответствуют физико-химическим параметрам, критичным для восстановления костной ткани. При небольшом содержании кальция и фосфора (1–2 мас.%) они способствовали ex vivo минерализации межклеточного вещества, сформированного в культуре ММСК жировой ткани человека. При 24-часовом контакте in vitro с 3D-композитами PLA-HAP в отличие от PLA-образцов на 9–10% возрастало число погибших (преимущественно путем некроза) лейкозных Jurkat Т-клеток, но не мононуклеарных лейкоцитов здорового добровольца.

Заключение

Заключение. Полярная реакция здоровых и опухолевых клеток на образцы PLA-HAP в случае увеличения содержания фосфатов кальция в составе 3D-композита может иметь значение при разработке новых материалов для эндопротезирования и остеосинтеза переломов у больных, страдающих гемобластозами.

The purpose of this study is to estimate Ex vivo physicochemical and biological features of three-dimensional (3D) biodegradable matrices “polylactic acid/calcium phosphates” (hereafter 3D composites) designed with the help of additive technologies (3D printing) as potential materials for bone tissue regeneration.

Materials and methods

Materials and methods. Experimental samples (disks 1,2–1,6 mm thick, and 11 mm or 8 mm in diameter) of composite biodegradable 3D matrices (hereafter 3D composites) have been produced from initial mixture of 95 mas% polylactic acid (PLA) and 5 mas% hydroxyapatite (HAP). Computer-aided design method, Blender software and fused filament fabrication (FFF; fiber diameter 1,75 mm) with 3D printing were used in sample production. 100 mas% PLA disks served as control. One of the sample surfaces was textured with 0,3–0,5 mm wide grooves. Physicochemical properties of 11 mm disks (geometry, mass, morphology, roughness, electrostatic voltage, surface wettability, and element composition) were studied. Biological trials included the evaluation of 24-hour cytotoxicity of 8 mm samples in culture of mononuclear leukocytes of a healthy volunteer or human Jurkat T cell leukemia-derived cell line (hereafter Jurkat T cells). Moreover, osteogenic potential of 11 mm disks was determined in 21-day culture of human adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AMMSCs) be means of osteocalcin secretion and intercellular matrix mineralization visualized by alizarin red S staining.

Results

Results. The features of PLA-HAP 3D composites generated by 3D printing correspond to physicochemical parameters which are crucial for bone tissue recovery. In case of small amount of calcium and phosphorus they facilitated ex vivo mineralization of extracellular matrix formed in AMMSCs culture. The number of died (by necrosis, mainly) leukemic Jurkat T cells but not mononuclear leukocytes of a health volunteer increased to 9–10% in 24-hour in vitro contact with PLA-HAP 3D composites unlike PLA samples alone.

Conclusion

Conclusion. Polar reaction of tumor and normal cells to PLA-HAP samples in case of increasing amount of calcium phosphates in 3D-composite may be valuable for the development of new materials used for osteosynthesis of fractures and endoprosthesis in patients with hematological malignancies.

3D-моделированиепрототипированиебиодеградируемые дискиin vitroцитотоксичностьстромальные стволовые клеткисекреция остеокальцинаокраска ализарином красным

3D-simulationprototypingbiodegradable disksin vitrocytotoxicitystromal stem cellsosteocalcin secretionalizarin red staining

профессор Ю.П. Шаркеев и В.В. Чебодаева (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск), канд. биол. наук В.В. Шуплецовой (Балтийский федеральный университет имени И. Канта, г. Калининград)

References1

Volova T.G. Polyhydroxyalkanoates – Plastic materials of the 21st century: production, properties, application. NY: Nova Science Pub., 2004: 282.

Volova T.G. Polyhydroxyalkanoates – Plastic materials of the 21st century: production, properties, application. NY: Nova Science Pub., 2004. 282 p.

Eling B., Gogolewski S., Pennings A.J. Biodegradable materials of poly(l-lactic acid): 1. Meltspun and solution spun fibers // Polymer. 1982; 23: 1587–1593.

Jukkala-Partio K., Laitinen O., Vasenius J., Partio E.K., Toivonen T., Tervahartiala P., Kinnunen J., Rokkanen P. Healing of subcapital femoral osteotomies fixed with self-reinforced poly-Llactide screws. An experimental long-term study in sheep // Arch. Orthop. Trauma Surg. 2022; 122: 360–364.

Çагородний Н.В., Королев А.В., Ахпашев А.А., Гнелица Н.Н., Ильин Д.О., Хасаншин М.М., Лягин А.С. Поведение имплантатов в костной ткани в различные сроки согласно МРТ-исследованию // Режим доступа: http://www.lechenie-sustavov.ru/patient/articles/povedenie-implantatov-v-kostnoj-tkani-v-razlichnye-sroki-soglasno-mrt-issledovaniyu/

Zagorodnii N.V., Korolev A.V., Ahpashev A.A., Gnelitsa N.N., Ilyin D.O., Khasanshin M.M., Liagin A.S. Povedenie implantatov v kostnoi tkani v hfzlichnye sroki soglasno MRT-issledovaniyu [Implants behavior in bone tissue at different periods according to MRT investigation]. Available at: http://www.lechenie-sustavov.ru/patient/articles/povedenie-implantatov-v-kostnoj-tkani-vrazlichnye-sroki-soglasno-mrt-issledovaniyu/(in Russian).

Shishatskaya E.I., Khlusov I.A., Volova T.G. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2006; 17 (5): 481–498.

Shishatskaya E.I., Khlusov I.A., Volova T.G. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation //J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2006; 17 (5): 481–498.

Tverdokhlebov S.I., Bolbasov E.N. , Shesterikov E.V., Antonova L.V., Golovkin A.S., Matveeva V.G., Petlin D.G., Anissimov Y.G. Modification of polylactic acid surface using RF plasma discharge with sputter deposition of a hydroxyapatite target for increased biocompatibility // Appl. Surf. Sci. 2015; 329: 32–39.

Chaikina M.V., Uvarov N.F., Ulihin A.S., Khlusov I.A. Mechanochemical synthesis of nanosized functional materials with the apatite-type structure // Problems of Materials Science. 2008; 54 (2): 219–232.

Хлусов И.А., Карлов А.В., Суходоло И.В. Генез костной ткани на поверхности имплантатов для остеосинтеза // Гений ортопедии. 2003; 3: 16–26.

Khlusov I.A., Karlov A.V., Soukhodolo I.V. Genez kostnoi tkani na poverhnosti implantatov dlya osteosinteza [Bone tissue genesis on the surface of the implants for osteosynthesis] // Genii ortopedii, Genius of Orthopedics, 2003; 3: 16–26 (in Russian).

Khlusov I.A., Sharkeev Yu. P., Pichugin V.F., Legostaeva E.V., Litvinova L.S., Shupletsova V.V., Sokhonevich N.A., Khaziakhmatova O.G., Khlusova M.Yu., Gutor S.S., Tolkacheva T.V. Influence of the Structure of the Titanium Oxide Coating Surface on Immunocompetent Tumor Cells // Russian Physics Journal. 2016; 58 (11): 1527–1533.

Bykova Iu., Weinhardt V., Kashkarova A., Lebedev S., Baumbach T., Pichugin V., Zaitsev K., Khlusov I. Physical properties and biocompatibility of UHMWPE-derived materials modified by synchrotron radiation // J. Mater. Sci: Mater Med. 2014; 25 (8): 1843–1852. doi: 10.1007/s10856-014-5222-4.

Owens D.K., Wendt R.C. Estimation of the surface free energy of polymers // J. Appl. Polym. Sci. 1969; 13: 1741–1747.

Kfoury Y., David T., Scadden D.T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche // Cell Stem Cell. 2015; 16: 239–253.

Steward A.J., Liu Y., Wagner D.R. Engineering cell attachments to scaffolds in cartilage tissue engineering // Biomater. Regen. Med. Eng. 2011; 63: 74–82.

Khlusov I.A., Karlov A.V., Sharkeev Yu.P., Pichugin V.F., Kolobov Yu.R., Shashkina G.A., Ivanov M.B., Legostaeva E.V., Sukhikh G.T. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow in situ: role of physicochemical properties of artificial surfaces // Bull. Exp. Biol. Med. 2005; 140 (1): 144–152.

Tverdokhlebov S.I., Stankevich K.S., Bolbasov E.N., Khlusov I.A., Kulagina I.V., Zaytsev K.V. Nonwoven polylactide scaffolds obtained by solution blow spinning and the in vitro degradation dynamics // Advanced Materials Research. 2014; 872: 257–263.

Tverdokhlebov S.I., Stankevich K. S. , Bolbasov E. N. , Khlusov I. A., Kulagina I. V. , Zaytsev K. V. Nonwoven polylactide scaffolds obtained by solution blow spinning and the in vitro degradation dynamics // Advanced Materials Research. 2014; 872: 257–263.

Khlusov I.A., Khlusova M.Y., Pichugin V.F., Sharkeev Y.P., Legostaeva E.V. Artificial Niches for Stromal Stem Cells as a Potential Instrument for the Design of the Surface of Biomimetic Osteogenic Materials // Russian Physics Journal. 2014; 56 (10): 1206–1211.

Hallab N.J., Bundy K.J., O’Connor K., Moses R.L., Jacobs J.J. Evaluation of metallic and polymeric biomaterial surface energy and surface roughness characteristics for directed cell adhesion // Tissue Eng. 2001; 7: 55–71.

Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 2nd edition / Eds. B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, & J.E. Lemons. San Diego: Elsevier Academic Press, 2004; 851 p.

Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А. Роль вегетативной нервной системы в регуляции гемопоýза. Томск, 1997; 218 с.

Goldberg E.D., Digai A.M., Khlusov I.A. Rol vegetativnoi nervnoi sistemi v regulyacii gemopoeza [The role of autonomous nervous system in hemopoiesis regulation]. Tomsk, 1997. 218 p. (in Russian).

Stevens M.J., Donato L..J, Lower S.K., Sahai N. Oxide-dependent adhesion of the Jurkat line of T lymphocytes // Langmuir. 2009; 25 (11): 6270–6278. doi: 10.1021/la8040192.

Terui Y., Ikeda M., Tomizuka H., Kasahara T., Ohtsuki T., Uwai M., Mori M., Itoh T., Tanaka M., Yamada M., Shimamura S., Ishizaka Y., Ikeda K., Ozawa K., Miura Y., Hatake K. Activated endothelial cells induce apoptosis in leukemic cells by endothelial interleukin-8 // Blood. 1998; 92 (8): 2672–2680.

Хлусов И.А., Сурменева М.A., Сурменев Р.А., Рязанцева Н.В., Савельева О.Е., Иванова А.А., Прохоренко Т.С., Таширева Л.А., Дворниченко М.В., Пичугин В.Ф. Клеточно-молекулярные аспекты иммунологической совместимости имплантатов с наноструктурным кальцийфосфатным покрытием // Бюл. сиб. медицины. 2012; 4: 78–85.

Khlusov I.A., Surmeneva M.A., Surmenev R.A., Ryazantseva N.V., Savelieva O.E., Ivanova A.A., Prokhorenko T.S., Tashireva L.A., Dvornichenko M.V., Pichugin V.F. Kletochno-molekulyarnye aspekty immunologicheskoi sovmestimosti implantatov s nanostrukturnym kalciiphosphatnym pokrytiem [Cellular and molecular aspects of immunologic compatibility of implants with nanostructured calcium phosphate coating] // Biulleten sibirskoi meditsiny – Bulletin of Siberian Medicine, 2012; 4: 78–85 (in Russian).

Хлусов И.А., Литвинова Л.С., Шуплецова В.В., Дунец Н.А., Хазиахматова О.Г., Юрова К.А., Хлусова М.Ю., Шаркеев Ю.П. Морфофункциональные изменения Т-лимфобластов линии Jurkat при краткосрочной контакте с рельефной кальцийфосфатной поверхностью // Цитология. 2017; 11 (1) (в печати).

Khlusov I.A., Litvinova L.S., Shupletsova V.V., Dunets N.A., Khaziakhmatova O.G., Yurova K.A., Khlusova M.Yu., Sharkeev Yu.P. Morphofunctional changes of Jurkat line lymphoblasts at short-term contact with relief calcium phosphate surface // Cell and Tissue Biology. 2017; 11 (1) (in press) (in Russian).

Oreffo R.O.C., Driessens F.C.M., Planell J.A., Triffitt J.T. Growth and differentiation of human bone marrow osteoprogenitors on novel calcium phosphate cements // Biomaterials. 1998; 19: 1845–1854.

Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Mesenchemal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation // Arthritis Res. Ther. 2007; 9: 204–219.

Риггз Б.Л., Мелтон Л.Дж. Остеопороз: пер. с англ. СПб.: БИНОМ, Невский диалект, 2000. 560 с.

Riggs B.L., Melton III L.J. Osteoporosis. Etiology, diagnosis, and management, second edn. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, New York, 1996 (Russ. ed.: Riggs B.L., Melton L.D. Osteoporoz: per. s angl. SPb.,ZAO Izdatelstvo BINOM Publ., Nevskii dialect Publ., 2000; 560 p.) (in Russian).

Kim H.M., Miyaji F., Kokubo T., Nakamura T. Bonding strength of bonelike apatite layer to Ti metal substrate // J. Biomed. Mater. Res. 1997; 38: 121–127.

Khlusov I.A., Shevtsova N.M., Khlusova M.Y. Detection in vitro and quantitative estimation of artificial microterritories which promote osteogenic differentiation and maturation of stromal stem cells // Methods Mol. Biol. 2013; 1035: 103–119. doi: 10.1007/978-1-62703-508-8_9.

Damien C.J., Ricci J.L., Christel P., Alexander H., Patat J.L. Formation of a calcium phosphate-rich layer on absorbable calcium carbonate bone graft substitutes // Calcif Tissue Int. 1994; 55: 151–158.

Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold // Cell. 1994; 78: 539–542.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.