ДЕТЕКЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ DNMT3A ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ МЕТОДОМ ПРЯМОГО АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Цель исследования – определить частоту точечных мутаций гена DNMT3A при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) методом прямого автоматического секвенирования.
Материал и методы. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 34 больных ОМЛ в возрасте от 21 до 64 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре (г. Екатеринбург) в период с 2012 по 2014 г., из них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 – 3 пациента, М1 – 1, М2 – 12, М3 – 3, М4 – 10, М5 – 2, М6 – 1, М7 – 1 пациент, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль обнаружена у одного больного. Выделение тотальной РНК из лейкозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе либо методом лизиса клеток с последующим связыванием РНК из раствора с мембраной (силикой) в миницентрифужной колонке с последующей обратной транскрипцией. Участки кДНК, соответствующие экзонам 18–26 гена DNMT3A, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Детекцию мутаций гена DNMT3A проводили методом прямого автоматического секвенирования с использованием генетического анализатора ABIPrism 310.
Результаты. Функционально значимые точечные мутации гена DNMT3A обнаруживались в 5,9% проб, во всех случаях – при ОМЛ, развившихся в исходе миелодиспластического синдрома, и были представлены несинонимичными нуклеотидными заменами. Частота детекции указанных мутаций при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и точечных мутаций гена ТР53 составляла 14,3%, что сопоставимо с данными многоцентровых международных исследований. Наряду с мутациями гена DNMT3A в указанных образцах определялись точечные мутации генов NPM1, KRAS, WT1. Во всех наблюдениях ОМЛ с мутациями гена DNMT3A ассоциировались с низкой эффективностью стандартной программной полихимиотерапии циторабином в сочетании с антрациклиновыми антибиотиками и неблагоприятным прогнозом.

1. Ley T.J., Ding L., Walter M.J., McLellan M.D., Lamprecht T., Larson D.E., Kandoth C., Payton J.E., Baty J., Welch J., Har-ris C.C., Lichti C.F., Townsend R.R., Fulton R.S., Dooling D.J., Koboldt D.C., Schmidt H., Zhang Q., Osborne J.R., Lin L., O'Laughlin M., McMichael J.F., Delehaunty K.D., McGrath S.D., Fulton L.A., Magrini V.J., Vickery T.L., Hundal J., Cook L.L., Conyers J.J., Swift G.W., Reed J.P., Alld-redge P.A., Wylie T., Walker J., Kalicki J., Watson M.A., Heath S., Shannon W.D., Varghese N., Nagarajan R., Westervelt P., Tomasson M.H., Link D.C., Grau¬bert T.A., DiPersio J.F., Mardis E.R., Wilson R.K. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // NEJM. 2010. V. 363, № 25. P. 2424–2433.

2. Thol F., Damm F., Lüdeking A., Winschel C., Wagner K., Morgan M., Yun H., Göhring G., Schlegelberger B., Hoelzer D., Lübbert M., Kanz L., Fiedler W., Kirchner H., Heil G., Krauter J., Ganser A., Heuser M. Incidence and prognostic influence of DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2011. V. 29, № 21. P. 2889–2896.

3. Marcucci G., Metzeler K.H., Schwind S., Becker H., Maharry K., Mrózek K., Radmacher M.D., Kohlschmidt J., Nicolet D., Whitman S.P., Wu Y.Z., Powell B.L., Car¬ter T.H., Kolitz J.E., Wetzler M., Carroll A.J., Baer M.R., Moore J.O., Caligiuri M.A., Larson R.A., Bloomfield C.D. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2012. V. 30, № 7. P. 742–750.

4. The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leu-kemia // NEJM. 2013. V. 368, № 22. P. 2059–2074.

5. Shlush L.I., Zandi S., Mitchell A., Chen W.C., Brandwein J.M., Gupta V., Kennedy J.A., Schimmer A.D., Schuh A.C., Yee K.W., McLeod J.L., Doedens M., Medeiros J.J., Marke R., Kim H.J., Lee K., McPherson J.D., Hudson T.J., HALT Pan-Leukemia Gene Panel Consortium, Brown A.M., Yousif F., Trinh Q.M., Stein L.D., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia // Nature. 2014. V. 506, № 7488. P. 328–333.

6. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues / Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L., Jaffe E. S., Pileri S. A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. Lyon: IARC, 2008. 439 p.

7. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мута-ций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Рос. он-колог. журн. 2013. № 4. С. 34–35.

8. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Ивлева Е.К., Сергеев А.Г. Разработка технологии детекции мутаций гена ASXL1 при острых миелоидных лейкозах методом прямого ав-томатического секвенирования // Материалы Всероссий-ской конференции с международным участием «Совре-менные проблемы биохимии и биотехнологии», 25–27 сентября 2013 г. Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. С. 20–23.

9. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов KRAS и NRAS при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автома-тического секвенирования // Вестн. Башкир. ун-та. 2014. Т. 19, № 3. С. 845–847.

10. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and max-imum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28, № 10. P. 2731–2739.

11. Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V., Szpurka H., Huang Y., Traina F., Visconte V., Sugimoto Y., Prince C., O'Keefe C., Hsi E.D., List A., Sekeres M.A., Rao A., McDevitt M.A., Maciejewski J.P. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes as-sociated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A // Blood. 2011. V. 118, № 14. P. 3932–3941.

12. Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J., Zhang W., Zhang W.N., Xiong S.M., Gu Z.H., Wang K.K., Zeng R., Chen Z., Chen S.J. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression / DNA methylation in hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111, № 7. P. 2620–2625.

13. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р., Иощен-ко С.Е., Сергеев А.Г. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуноги-стохимического метода // Вестн. Урал. мед. академ. нау-ки. 2013. № 4. С. 124–127.

14. Subramaniam D., Thombre R., Dhar A., Anant S. DNA methyltransferases: a novel target for prevention and therapy // Front. Oncol. 2014. № 1. P. 80.