Молекулярные механизмы влияния N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

Актуальность. Нарушение регуляции апоптоза в эпителиальных опухолевых клетках линии Р19 сопряжено с формированием окислительного стресса. В условиях гипоксии происходит изменение функционирования митохондрий, что может выступать дополнительным фактором, усугубляющим  окислительный стресс в опухолевой клетке.

Цель – оценить влияние N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на реализацию и регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии in vitro.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили культивированные в условиях гипоксии опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши). Для модуляции редокс-статуса использовали N-этилмалеимид в концентрации 5 мМ и протектор SH-групп – 1,4-дитиоэритритол в конечной
концентрации 5 мМ. Методом проточной цитофлуориметрии определяли внутриклеточное содержание ионов кальция, трансмембранный потенциал митохондрий, количество аннексин V-, CD95- и CD120-положительных клеток. Концентрацию восстановленного, окисленного и белково-связанного глутатиона, SH-групп протеинов, гидроксильного радикала и карбонильных производных белков измеряли методом спектрофотомерии.

Результаты. В условиях гипоксии изменение редокс-статуса системы глутатиона, сопровождающееся окислительной модификацией белков (глутатионилирование и карбонилирование), оказывает влияние на метаболизм опухолевой клетки в целом и, при применении протектора SH-групп белков – 1,4-дитиоэритритола, способствует формированию дополнительных механизмов ускользания от клеточной гибели, а в случае применения блокатора SH-групп протеинов – N-этилмалеимида – активации апоптоза.

Заключение. В условиях гипоксии изменение редокс-гомеостаза опухолевой клетки и модуляция окислительной модификации белков (глутатионилирование и карбонилирование) являются одним из перспективных подходов таргетной регуляции клеточной гибели.

1. Sinha K., Das J., Pal P.B., Sil P.C. Oxidative stress: the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis. Archives of Toxicology. 2013; 87 (7): 1157–1180. DOI: 10.1007/s00204-013-1034-4.

2. Redza-Dutordoir M., Averill-Bates D.A. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species. Biochim. Biophys. Acta. 2016; 1863 (12): 2977–2992. DOI: 10.1016/j.bbamcr.2016.09.012.

3. Moldogazieva N.T., Mokhosoev I.M., Feldman N.B., Lutsenko S.V. ROS and RNS signalling: adaptive redox switches through oxidative/nitrosative protein modifications. Free Radical Research. 2018; 52 (5): 507–543. DOI: 10.1080/10715762.2018.1457217.

4. Tew K.D., Manevich Y., Grek C., Xiong Y., Uys J., Townsend D.M. The role of glutathione S-transferase P in signaling pathways and S-glutathionylation in cancer. Free Radical Biology and Medicine. 2011; 51 (2): 299–313. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.04.013.

5. Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Закирова Е.В., Наумова А.И., Веснина О.Н., Орлов Д.С., Шахристова Е.В., Иванов В.В., Новицкий В.В. Роль окислительной модификации белков в редокс-зависимой регуляции апоптоза опухолевых клеток. Молекулярная медицина. 2015; 4: 60–64.

6. Patwardhan R.S., Sharma D., Checker R., Thoh M., Sandur S.K. Spatio-temporal changes in glutathione and thioredoxin redox couples during ionizing radiation-induced oxidative stress regulate tumor radio-resistance. Free Radical Research. 2015; 49 (10): 1218–1232. DOI: 10.3109/10715762.2015.1056180.

7. Shakhristova E.V., Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Yakushina V.D., Ivanov V.V., Novitskii V.V. Role of glutathione system redox potential in apoptosis dysregulation in MCF-7 breast adenocarcinoma. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2016; 160 (3): 364–367. DOI: 10.1007/s10517-016-3172-1.

8. Shashova E.E., Astakhova T.M., Plekhanova A.S., Bogomyagkova Y.V., Lyupina Y.V., Sumedi I.R., Slonimskaya E.M., Erokhov P.A., Abramova E.B., Rodoman G.V., Kuznetsov N.A., Kondakova I.V., Sharova N.P., Choinzonov E.L. Changes in

9. proteasome chymotrypsin-like activity during the development of human mammary and thyroid carcinomas. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2013; 156 (2): 242–244.

10. Kondakova I.V., Spirina L.V., Koval V.D., Shashova E.E., Choinzonov E.L., Ivanova E.V., Kolomiets L.A., Chernyshova A.L., Slonimskaya E.M., Usynin E.A., Afanasev S.G. Chymotrypsin-like activity and subunit composition of proteasomes in human cancers. Molecular Biology. 2014; 48 (3): 384–389.

11. Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Nosareva O.L., Konovalova E.V., Orlov D.S., Naumova A.I., Didenko S.A., Vesnina O.N., Shakhristova E.V., Zima A.P., Novitskii V.V. Role of heat shock protein 27 in regulation of glutathione system and apoptosis of Jurkat tumor cells and blood lymphocytes. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2015; 158 (3): 377–379. DOI: 10.1007/s10517-015-2766-3.

12. Marengo B., Nitti M., Furfaro A.L., Colla R., Ciucis C.D., Marinari U.M., Pronzato M.A., Traverso N., Domenicotti C. Redox homeostasis and cellular antioxidant systems: crucial players in cancer growth and therapy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016; 2016: 6235641. DOI: 10.1155/2016/6235641.

13. Zhang T., Suo C., Zheng C., Zhang H. Hypoxia and metabolism in metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019; 1136: 87–95. DOI: 10.1007/978-3-030-12734-3_6.

14. Степовая Е.А., Шахристова Е.В., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Чильчигашев Р.И., Егорова М.Ю. Система тиоредоксина в регуляции пролиферации клеток линии MCF-7 при модуляции редокс-статуса. Сибирский онкологический журнал. 2016; 15 (4): 50–55. DOI: 10.21294/1814-4861-2016-15-4-50-55.

15. Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. Lymphocyte surface thiol levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (7): 4001–4005. DOI: 10.1073/pnas.2628032100

16. Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1995; 316 (1): 327–334. DOI: 10.1006/abbi.1995.1044

17. Thom S.R., Elbuken M.E. Oxygen-dependent antagonism of lipid peroxidation. Free Radical Biology and Medicine. 1991; 10 (6): 413–426. DOI: 10.1016/0891-5849(91)90050-d

18. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты организма. СПб.: Фолиант, 2000: 103.

19. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth. Journal of Radiation Research. 2004; 45 (1): 33–39. DOI: 10.1269/jrr.45.33.

20. Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B., Leinbach E.D., Berlin R.D. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes. Journal of Cell Biology. 1978; 76 (2): 439–447. DOI: 10.1083/jcb.76.2.439.

21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976; 72: 248–254. DOI: 10.1006/abio.1976.9999.

22. Merritt J.E., McCarthy S.A., Davies M.P., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. The Biochemical Journal. 1990; 269 (2): 513–519. DOI: 10.1042/bj2690513.

23. Munro D., Treberg J.R. A radical shift in perspective: mitochondria as regulators of reactive oxygen species. The Journal of Experimental Biology. 2017; 220 (Pt 7): 1170–1180. DOI: 10.1242/jeb.132142.

24. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О. Некоторые принципы и механизмы редокс-регуляции. Кислород и антиоксиданты. 2009; 1: 3–64.

25. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2017: 284.

26. Орлов Д.С., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Носарева О.Л., Шахристова Е.В., Иванов В.В. Редокс-зависимые механизмы дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток при гипоксии. Сибирский научный медицинский журнал. 2017; 37 (1): 21–26.