Исследование транскриптома плоскоклеточного рака головы и шеи после протонного облучения

Цель – оценить изменения транскриптома клеток ткани плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) у пациентов после протонного облучения.

Материалы и методы. Биопсийный материал, полученный от трех пациентов ПРГШ до и после протонного облучения в суммарной дозе 10 изоГр, был подвергнут гомогенизации, очистке и концентрации. После чего была выделена тотальная РНК с последующей очисткой и концентрацией набором RNA Clean & Concentrator (Zymo Research), количество оценивали с помощью прибора Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies). После выделения тотальной РНК из 1 мкг для секвенирования на платформе Illumina были приготовлены библиотеки с использованием набора TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 с этапом обогащения в 10 циклов в соответствии с рекомендациями производителя. Качество РНК и полученных библиотек проверялось с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Tec. Inc., США). Параметр RIN для РНК составлял не менее 7. Концентрацию библиотек оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Окончательные библиотеки объединяли в эквимолярных пропорциях перед секвенированием на платформе Illumina HiSeq 2500 с использованием парно-концевых прочтений по 50 оснований. Параметр Q20 для всех образцов составил более 97%, а количество прочтений в среднем равнялось 60,2 млн на образец. Cырые прочтения были обработаны с использованием RTA 1.17.21.3 и Casava 1.8.2 (Illumina). Анализ обогащения был выполнен с помощью программного обеспечения PANTHER 17.0.

Результаты. В ходе транскриптомного анализа ПРГШ после пятикратного облучения пациентов протонами (2 изоГр) в суммарной дозе 10 изоГр было обнаружено 1 414 значимо дифференциально экспрессированных генов. Выделены 10 наиболее и наименее экспрессируемых генов и ассоциированные с ними сигнальные пути. В ПРГШ после облучения протонами обнаружен ряд сигнальных путей, связанных с низкоэкспрессированными генами, таких как STAT5; сигнальный путь PD-1; отмечена MET-опосредованная активация сигнального пути PTK2, передача сигналов PDGF; CD22-опосредованная регуляция BCR; активация MAPK, опосредованная FCERI. Кроме вышеназванных сигнальных путей обращает на себя внимание активация процесса распада коллагена, FCGR3A-опосредованного фагоцитоза и FCGR3A-опосредованного синтеза интерлейкина-10 (IL10). При анализе обогащения среди высокоэкспрессируемых генов в ткани ПРГШ после протонного облучения были активированы процессы ороговения и биологического окисления.

Заключение. Облучение протонами при ПРГШ приводит к гиперэкспрессии генов, вовлеченных в регуляцию процессов ороговения и биологического окисления; гипоэкспрессии генов, связанных с подавлением сигнальных путей: STAT5, PD-1, MET-опосредованной активации сигнального пути PTK2, передачи сигналов PDGF; CD22-опосредованной регуляции BCR; активации MAPK, опосредованной FCERI, процесса распада коллагена, активации FCGR3A-опосредованного фагоцитоза и FCGR3A-опосредованного синтеза IL10. Все сигнальные пути гипоэкспрессированных генов функционируют в клетках ПРГШ, если негативного влияния на опухоль не оказывается извне (облучение или поступление противоопухолевых препаратов). Преобладание подавленных сигнальных путей над активированными, вероятнее всего, свидетельствует о снижении функционального потенциала клеток после облучения протонами. Дозозависимость эффектов ПТ обусловливает необходимость дальнейшего изучения изменений клеточных и молекулярно-генетических сигнатур ПРГШ после протонного облучения разными дозами.

1. Sung H., Ferlay J., Siegel R.L., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A., Bray F. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 2021;71(3):209–249. DOI: 10.3322/caac.21660.

2. Bhat G.R., Hyole R.G., Li J. Head and neck cancer: Current challenges and future perspectives. In Advances in Cancer Research. 2021;152(1):67–102. DOI: 10.1016/bs.acr.2021.05.002.

3. Johnson D.E., Burtness B., Leemans C.R., Lui W.Y., Bauman J.E., Grandis J.R. Head and neck squamous cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 2020;6(1):92–112. DOI: 10.1038/s41572-020-00224-3.

4. Lozano R., Naghavi M., Foreman K., Lim S., Shibuya K., Aboyans V. et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2012;380(9859):2095–2128. DOI: 10.1016/S0140-6736(12)61728-0.

5. Borras J.M., Barton M., Grau C., Corral J., Verhoeven R., Lemmens V. et al. The impact of cancer incidence and stage on optimal utilization of radiotherapy: Methodology of a population based analysis by the ESTRO-HERO project. Radiotherapy and Oncology. 2015;116(1):45–50. DOI: 10.1016/j.radonc.2015.04.021.

6. Vitti E.T., Parsons J.L. The radiobiological effects of proton beam therapy: Impact on DNA damage and repair. Cancers. 2019;11(7):1–15. DOI: 10.3390/cancers11070946.

7. Răileanu M., Straticiuc M., Iancu D.A., Andrei R.F. Proton irradiation induced reactive oxygen species promote morphological and functional changes in HepG2 cells. Journal of Structural Biology. 2022;214(4):1–11. DOI: 10.1016/j.jsb.2022.107919.

8. Alan Mitteer R., Wang Y., Shah J., Gordon S., Fager M., Butter P.P. et al. Proton beam radiation induces DNA damage and cell apoptosis in glioma stem cells through reactive oxygen species. Scientific Reports. 2015;5(1):1–12. DOI: 10.1038/srep13961.

9. Jumaniyazova E.D., Smyk D.I., Vishnyakova P.A., Fatkhudinov T.Kh., Gordon K.B. Photon-and proton-mediated biological effects: what has been learned? Life. 2022;3(1):30–46. DOI: 10.3390/life13010030.

10. Nuyts S., Bollen H., Ng S.P., Corry J., Eisbruch A., Mendenhall W.M. et al. Proton therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck: early clinical experience and current challenges. Cancers. 2022;14(11):1–18. DOI: 10.3390/cancers14112587.

11. Holliday E.B., Garden A.S., Rosenthal D.I., Fuller C.D., Morrison W.H., Gunn G.B. et al. Proton therapy reduces treatment-related toxicities for patients with nasopharyngeal cancer: a case-match control study of intensity-modulated proton therapy and intensity-modulated photon therapy. International Journal of Particle Therapy. 2015;2(1):19–28. DOI: 10.14338/IJPT-15-00011.1.

12. Tian X., Liu K., Hou Y., Cheng J., Zhang J. The evolution of proton beam therapy: Current and future status. Molecular and Clinical Oncology. 2018;8(1):15–21. DOI: 10.3892/mco.2017.1499.

13. Stupnikov A., Sizykh A., Budkina A., Sizykh А., Budkina A., Favorov A. et al. Hobotnica: exploring molecular signature quality [version 2; peer review: 2 approved]. F1000Research. 2022:10:1260. DOI: 10.12688/f1000research.74846.2.

14. Rodon J., Soria J.C., Berger R., Miller W.H., Rubin E., Kugel A. et al. Genomic and transcriptomic profiling expands precision cancer medicine: the WINTHER trial. Nature Medicine. 2019;25(5):751–758. DOI: 10.1038/s41591-019-0424-4.

15. Worst B.C., van Tilburg C.M., Balasubramanian G.P., Fiesel P., Witt R., Freitag A. et al. S. Next-generation personalised medicine for high-risk paediatric cancer patients– The INFORM pilot study. European Journal of Cancer. 2016;65(1):91–101. DOI: 10.1016/j.ejca.2016.06.009.

16. Choi S., Myers J.N. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma: implications for therapy. Journal of Dental Research. 2008;87(1):14–32. DOI: 10.1177/154405910808700104.

17. Koppikar P., Lui V.W.Y., Man D., Xi S., Chai R.L., Nelson E. et al. Constitutive activation of STAT5 contributes to tumor growth, epithelial-mesenchymal transition, and resistance to EGFR targeting. Clinical Cancer Research. 2008;14(23):7682– 7690. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-08-1328.

18. Zhou J., Yi Q., Tang, L. The roles of nuclear focal adhesion kinase (FAK) on Cancer: a focused review. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2019;38(1):1–11. DOI: 10.1186/s13046-019-1265-1.

19. Zhang Z., Li J., Jiao S., Han G., Zhu J., Liu T. Functional and clinical characteristics of focal adhesion kinases in cancer progression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022;10(1):1040311–1040335. DOI: 10.3389/fcell.2022.1040311.

20. Skinner H.D., Giri U., Yang L., Woo S.H., Story M.D., Pickering C.R. et al. Proteomic profiling identifies PTK2/FAK as a driver of radioresistance in HPV-negative head and neck cancer. Clinical Cancer Research. 2016;22(18):4643–4650. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2785.

21. Chen L., Han X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. The Journal of Clinical Investigation. 2015;125(9):3384–3391. DOI: 10.1172/JCI80011.

22. Cui P., Jing P., Liu X., Xu W. Prognostic significance of PD-L1 expression and its tumor-intrinsic functions in hypopharyngeal squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 2020;1:5893–5902. DOI: 10.2147/CMAR.S257299.

23. Han Y., Liu D., Li L. PD-1/PD-L1 pathway: current researches in cancer. American Journal of Cancer Research. 2020;10(3):727–742.

24. Howell W.M., Rose-Zerilli M.J. Cytokine gene polymorphisms, cancer susceptibility, and prognosis. The Journal of Nutrition. 2007;137(1):194S–199S. DOI: 10.1093/jn/137.1.194S.

25. Jiang Y. IL10 receptor is a novel therapeutic target in DLBCLs. Leukemia. 2015;29(8):1684–1694. DOI: 10.1038/leu.2015.57.

26. Han Y., Ding Z., Chen B., Liu Y., Liu Y. A novel inflammatory response–related gene signature improves high-risk survival prediction in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Frontiers in Genetics. 2022;13(1):1–15. DOI: 10.3389/fgene.2022.767166.

27. Heldin C.H. Targeting the PDGF signaling pathway in tumor treatment. Cell Communication and Signaling. 2013;11:1–18. DOI: 10.1186/1478-811X-11-97.

28. Pietras K., Sjöblom T., Rubin K., Heldin C.H., Östman A. PDGF receptors as cancer drug targets. Cancer Cell. 2003;3(5):439–443. DOI: 10.1016/s1535-6108(03)00089-8.

29. Lindahl P., Johansson B.R., Leveen P., Betsholtz C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 1997;277(5323):242–245. DOI: 10.1126/science.277.5323.242.

30. Heldin C.H., Rubin K., Pietras K., Östman A. High interstitial fluid pressure—an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2004;4(10):806–813. DOI: 10.1038/nrc1456.

31. Braicu C., Buse M., Busuioc C., Drula R., Gulei D., Raduly L. et al. A comprehensive review on MAPK: a promising therapeutic target in cancer. Cancers. 2019;11(10):1–25. DOI: 10.3390/cancers11101618.

32. Theocharis S., Kotta-Loizou I., Klijanienko J., Giaginis C., Alexandrou P., Rodriguez J. et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) expression and activation in mobile tongue squamous cell carcinoma: associations with clinicopathological parameters and patients survival. Tumor Biology. 2014;35:6455–6465. DOI: 10.1007/s13277-014-1853-9.

33. Kaneko T., Zeng P.Y., Liu X., Abdo R., Barrett J.W., Zhang Q. et al. Proteome and phosphoproteome signatures of recurrence for HPV+ head and neck squamous cell carcinoma. Communications Medicine. 2022;2(1):95–110. DOI: 10.1038/s43856-022-00159-8.

34. Cooper T., Biron V.L., Adam B., Klimowicz A.C., Puttagunta L., Seikaly H. Association of keratinization with 5-year disease-specific survival in oropharyngeal squamous cell carcinoma. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 2015;141(3):250– 256. DOI: 10.1001/jamaoto.2014.3335.