Функциональный анализ новой мутации сплайсинга c.2067+2T>G в гене MYBPC3 при гипертрофической кардиомиопатии

Цель – исследование патогенного эффекта варианта в сайте сплайсинга MYBPC3 у пациента с гипертрофической кардиомиопатией.
Материалы и методы. Исследование проведено с использованием образца ДНК пациентки с гипертрофической кардиомиопатией, у которой был выявлен ранее не описанный вариант в донорном сайте сплайсинга интрона 21. Применены методы конструирования и клонирования мини-генов (вектор pSpl3- Flu2-TKdel), трансфекции культуры клеток человека (HEK293T), с последующим выделением мРНК, получением кДНК, ПЦР участка мини-гена, содержащего анализируемый фрагмент, электрофореза в агарозном геле, секвенирования по Сэнгеру.
Результаты. Вариант chr11:47339649-A-C (hg38), нарушающий донорный сайт сплайсинга в интроне 21 (NM_000256.3: c.2067+2T>G), был выявлен у пациентки 23 лет с обструктивной формой гипертрофической кардиомиопатии. Для прямого анализа влияния этого варианта на сплайсинг был получен вектор, содержащий экзон 21, интрон 21, экзон 22, частично интроны 20 и 22 MYBPC3. Сравнение мРНК, полученных для мини-генов, содержащих или несодержащих исследуемый вариант, показало, что замена chr11:47339649-A-C приводит к пропуску экзонов 21 и 22 в процессе сплайсинга.
Заключение. В результате исследования установлена функциональная значимость ранее не описанного варианта c.2067+2T>G в гене MYBPC3, приводящего к нарушению механизма сплайсинга мРНК у пациента с гипертрофической кардиомиопатией. Данный вариант может быть классифицирован как патогенный.

1. Maron B.J., Towbin J.A., Thiene G., Antzelevitch C., Corrado D., Arnett D. et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation. 2006;113(14):1807–1816. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.174287.

2. Semsarian C., Ingles J., Maron M.S., Maron B.J. New perspectives on the prevalence of hypertrophic cardiomyopathy. J. Am. Coll. Cardiol. 2015;65(12):1249–1254. DOI: 10.1016/j.jacc.2015.01.019

3. Ingles .J, Goldstein J., Thaxton C., Caleshu C., Corty E.W., Crowley S.B. et al. Evaluating the Clinical validity of hypertrophic cardiomyopathy genes. Circ. Genom. Precis. Med. 2019;12(2):e002460. DOI: 10.1161/CIRCGEN.119.002460.

4. Carrier L. Targeting the population for gene therapy with MYBPC3. J. Mol. Cell Cardiol. 2021;150:101–108. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2020.10.003.

5. Behrens-Gawlik V., Mearini G., Gedicke-Hornung C., Richard P., Carrier L. MYBPC3 in hypertrophic cardiomyopathy: from mutation identification to RNA-based correction. Pflugers Arch. 2014;466(2):215–223. DOI: 10.1007/s00424-013-1409-7.

6. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet. Med. 2015;17(5):405–424. DOI: 10.1038/gim.2015.30.

7. Gaildrat P., Killian A., Martins A., Tournier I., Frébourg T., Tosi M. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods Mol. Biol. 2010;653:249–257. DOI: 10.1007/978-1-60761-759-4_15.

8. Desviat L.R., Pérez B., Ugarte M. Minigenes to confirm exon skipping mutations. Methods Mol. Biol. 2012;867:37–47. DOI: 10.1007/978-1-61779-767-5_3.

9. Kopanos C., Tsiolkas V., Kouris A., Chapple C.E., Albarca Aguilera M., Meyer R. et al. Var Some: the human genomic variant search engine. Bioinformatics. 2019;35(11):1978–1980. DOI: 10.1093/bioinformatics/bty897.

10. Filatova A.Y., Vasilyeva T.A., Marakhonov A.V., Voskresenskaya A.A., Zinchenko R.A., Skoblov M.Y. Functional reassessment of PAX6 single nucleotide variants by in vitro splicing assay. Eur. J. Hum. Genet. 2019;27(3):488–493. DOI: 10.1038/s41431-018-0288-y.

11. Shenasa H., Hertel K.J. Combinatorial regulation of alternative splicing. Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech. 2019;1862(11–12):194392. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2019.06.003.

12. Baralle D., Baralle M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. J. Med. Genet. 2005;42(10):737–748. DOI: 10.1136/jmg.2004.029538.

13. Suay-Corredera C., Pricolo M.R., Herrero-Galán E., Velázquez-Carreras D., Sánchez-Ortiz D., García-Giustiniani D. et al. Protein haploinsufficiency drivers identify MYBPC3 variants that cause hypertrophic cardiomyopathy. J. Biol. Chem. 2021;297(1):100854. DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100854.

14. Helms A.S., Tang V.T., O’Leary T.S., Friedline S., Wauchope M., Arora A. et al. Effects of MYBPC3 loss-of-function mutations preceding hypertrophic cardiomyopathy. JCI Insight. 2020;5(2):e133782. DOI: 10.1172/jci.insight.133782.

15. Seeger T., Shrestha R., Lam C.K., Chen C., McKeithan W.L., Lau E. et al. A Premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 2019;139(6):799–811. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034624.

16. Singer E.S., Ingles J., Semsarian C., Bagnall R.D. Key Value of RNA analysis of MYBPC3 splice-site variants in hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom Precis. Med. 2019;12(1):e002368. DOI: 10.1161/CIRCGEN.118.002368.

17. Lopes L.R., Barbosa P., Torrado M., Quinn E., Merino A., Ochoa J.P. et al. Cryptic splice-altering variants in MYBPC3 are a prevalent cause of hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Genom. Precis. Med. 2020;13(3):e002905. DOI: 10.1161/CIRCGEN.120.002905.

18. Torrado M., Maneiro E., Lamounier Junior A., FernándezBurriel M., Sánchez Giralt S., Martínez-Carapeto A. et al. Identification of an elusive spliceogenic MYBPC3 variant in an otherwise genotype-negative hypertrophic cardiomyopathy pedigree. Sci. Rep. 2022;12(1):7284. DOI: 10.1038/s41598-022-11159-y.

19. GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369(6509):1318–1330. DOI: 10.1126/science.aaz1776.