Оценка функциональной пригодности лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях

Цель – изучить in vitro и in vivo функциональную пригодность лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами DARPin G3-(GGGS)₃Cys, меченых ^99mTc, для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях.

Материалы и методы. Для наработки таргетного белка использовали модифицированную генетическую конструкцию с последовательностью, кодирующей белок DARPin G3-(GGGS)₃Cys. Для получения экспериментального препарата использовали лиофилизат, содержащий DARPin G3-(GGGS)₃Cys со вспомогательными веществами, и раствор натрия пертехнетата, ^99mТс (500 МБк) при инкубации 60 °С, 30 мин. Анализ радиохимической чистоты (РХЧ) ^99mTс-G3-(GGGS)₃Cys проводили тонкослойной радиохроматографией. Для оценки специфичности in vitro использовали клеточные линии: SKOV-3 > BT-474 > DU-145. Константу диссоциации определяли с помощью анализа насыщения на SKOV-3 в диапазоне концентраций белка от 0,2 до 40 нМ. Для оценки таргетных свойств и биораспределения использовали мышей линии Nu/j, несущих ксенотрансплантаты SKOV-3 (HER2/neu позитивные) и ксенотрансплантаты Ramos (HER2/neu негативные).

Результаты. Получен радиокомплекс на основе ^99mTс и лиофилизата таргетных белков DARPin G3(GGGS)₃Cys  с  РХЧ  более  96%.  Связывание  ^99mTс-G3-(GGGS)₃Cys  с  клетками  является  специфичным c K_D  3,9 ± 0,5 нМ и пропорционально уровню экспрессии HER2/neu в клетках. Поглощение ^99mTс-G3-(GGGS)₃Cys в ксенотрансплантатах SKOV-3 было значимо выше, чем в ксенотрансплантатах Ramos. ^99mTсG3-(GGGS)₃Cys продемонстрировал быстрое выведение из крови, почечный клиренс, низкие уровни активности в слюнных железах и желудке. Уровень накопления активности в печени составил около 5–7 %ВД/г. Кроме того, ^99mTс-G3-(GGGS)₃Cys имел очень низкое поглощение в легких, мышцах, тонком кишечнике и костях.

Заключение. Лиофилизат таргетных каркасных белков DARPin G3-(GGGS)₃Cys, меченый ^99mTc, функционально пригоден для визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в опухолях, поскольку специфически связывается с рецептором, стабилен in vivo и имеет благоприятное биораспределение в органах и тканях. Радиокомплекс ^99mTс-G3-(GGGS)₃Cys получен по простой процедуре с высокой радиохимической чистотой.

1. Roskoski R. Jr. Small molecule inhibitors targeting the EGFR/ErbB family of protein-tyrosine kinases in human cancers. Pharmacol. Res. 2019;139:395–411. DOI: 10.1016/j. phrs.2018.11.014.

2. Swain S.M., Shastry M., Hamilton E. Targeting HER2-positive breast cancer: advances and future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2023;22(2):101–126. DOI: 10.1038/s41573-02200579-0.

3. Giordano S.H., Franzoi M.A.B., Temin S., Anders C.K., Chandarlapaty S., Crews J.R. et al. Systemic therapy for advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer: ASCO guideline update. J. Clin. Oncol. 2022;40(23):2612–2635. DOI: 10.1200/jco.22.00519.

4. Al-Batran S.E., Moorahrend E., Maintz C., Goetze T.O., Hempel D., Thuss-Patience P. et al. Clinical practice observation of trastuzumab in patients with human epidermal growth receptor 2-positive metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction. Oncologist. 2020;25(8):e1181– 118e7. DOI: 10.1634/theoncologist.2020-0109.

5. Swain S.M., Miles D., Kim S.B., Im Y.H., Im S.A., Semiglazov V. et al. Pertuzumab, trastuzumab, and docetaxel for HER2-positive metastatic breast cancer (CLEOPATRA): endof-study results from a double-blind, randomised, placebo-controlled, phase 3 study. Lancet Oncol. 2020;21(4):519–530. DOI: 10.1016/s1470-2045(19)30863-0.

6. Lorusso D., Hilpert F., González Martin A., Rau J., Ottevanger P., Greimel E. et al. Patient-reported outcomes and final overall survival results from the randomized phase 3 PENELOPE trial evaluating pertuzumab in low tumor human epidermal growth factor receptor 3 (HER3) mRNA-expressing platinum-resistant ovarian cancer. Int. J. Gynecol. Cancer. 2019;29(7):1141–1147. DOI: 10.1136/ijgc-2019-000370.

7. Li B.T., Smit E.F., Goto Y., Nakagawa K., Udagawa H., Mazières J. et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2-mutant non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 2022;386(3):241– 251. DOI: 10.1056/NEJMoa2112431.

8. Tymon-Rosario J., Siegel E.R., Bellone S., Harold J., Adjei N., Zeybek B. et al. Trastuzumab tolerability in the treatment of advanced (stage III-IV) or recurrent uterine serous carcinomas that overexpress HER2/neu. Gynecol. Oncol. 2021;163(1):93– 99. DOI: 10.1016/j.ygyno.2021.07.033.

9. Modi S., Jacot W., Yamashita T., Sohn J., Vidal M., Tokunaga E. et al. Trastuzumab deruxtecan in previously treated HER2-Low advanced breast cancer. N. Engl. J. Med. 2022;387(1):9–20. DOI: 10.1056/NEJMoa2203690.

10. Брагина О.Д., Деев С.М., Гарбуков Е.Ю., Гольдберг В.Е., Чернов В.И., Толмачев В.М. Прямое сравнение диагностической эффективности радиофармацевтических препаратов на основе альтернативных каркасных протеинов [99mTc] Tc-ADAPT6 и [99mTc] Tc-(HE) 3-G3 у больных HER2-позитивным раком молочной железы. Бюллетень сибирской медицины. 2023;22(3):6–13.

11. Sörensen J., Velikyan I., Sandberg D., Wennborg A., Feldwisch J., Tolmachev V. et al. Measuring HER2-receptor expression in metastatic breast cancer using [68Ga]ABY-025 affibody PET/CT. Theranostics. 2016;6(2):262–271. DOI: 10.7150/thno.13502.

12. Deyev S., Vorobyeva A., Schulga A., Proshkina G., Güler R., Löfblom J. et al. Comparative evaluation of two DARPin variants: effect of affinity, size, and label on tumor targeting properties. Mol. Pharm. 2019;16(3):995–1008. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00922.

13. Bragina O., Chernov V., Larkina M., Rybina A., Zelchan R., Garbukov E. et al. Phase I clinical evaluation of (99m)Tc-labeled affibody molecule for imaging HER2 expression in breast cancer. Theranostics. 2023;13(14):4858–4871. DOI: 10.7150/thno.86770.

14. Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2015;55:489–511. DOI: 10.1146/annurev-pharmtox-010611-134654.

15. Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G. et al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2015;42(2):288–301. DOI: 10.1007/s00259-014-2940-2.

16. Vorobyeva A., Schulga A., Konovalova E., Güler R., Löfblom J., Sandström M. et al. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of (99m)Tc-labeled DARPin G3. Sci. Rep. 2019;9(1):9405. DOI: 10.1038/s41598-019-45795-8.

17. Tolmachev V., Orlova A., Sörensen J. The emerging role of radionuclide molecular imaging of HER2 expression in breast cancer. Semin. Cancer Biol. 2021;72:185–197. DOI: 10.1016/j.semcancer.2020.10.005.

18. Bragina O., Chernov V., Schulga A., Konovalova E., Garbukov E., Vorobyeva A. et al. Phase I trial of (99m)Tc-(HE) (3)-G3, a DARPin-based probe for imaging of HER2 expression in breast cancer. J. Nucl. Med. 2022;63(4):528–535. DOI: 10.2967/jnumed.121.262542.

19. Larkina M., Plotnikov E., Bezverkhniaia E., Shabanova Y., Tretyakova M., Yuldasheva F. et al. Comparative preclinical evaluation of peptide-based chelators for the labeling of DARPin G3 with (99m)Tc for radionuclide imaging of HER2 expression in cancer. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(21). DOI: 10.3390/ijms232113443.

20. Malakhov M.P., Mattern M.R., Malakhova O.A., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J. Struct Funct Genomics. 2004;5(1-2):75–86. DOI: 10.1023/b:Jsfg.0000029237.70316.52.

21. Cleland J.L., Jones A.J. Stable formulations of recombinant human growth hormone and interferon-gamma for microencapsulation in biodegradable microspheres. Pharm. Res. 1996;13(10):1464–1475. DOI: 10.1023/a:1016063109373.

22. Riihimäki M., Thomsen H., Sundquist K., Sundquist J., Hemminki K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Med. 2018;7(11):5534–5542. DOI: 10.1002/cam4.1697.

23. Bragina O., Chernov V., Schulga A., Konovalova E., Hober S., Deyev S. et al. direct intra-patient comparison of scaffold protein-based tracers, [(99m)Tc]Tc-ADAPT6 and [(99m) Tc]Tc-(HE)(3)-G3, for imaging of HER2-positive breast cancer. Cancers (Basel). 2023;15(12). DOI: 10.3390/cancers15123149.

24. Bragina O., von Witting E., Garousi J., Zelchan R., Sandström M., Orlova A. et al. Phase I study of (99m)Tc-ADAPT6, a scaffold protein-based probe for visualization of HER2 expression in breast cancer. J. Nucl. Med. 2021;62(4):493–499. DOI: 10.2967/jnumed.120.248799.