Динамические изменения целостности РНК, экспрессии генов и патоморфология тканей экспериментальных мышей в посмертном периоде

Цель. Изучение закономерности морфологических изменений, величины целостности РНК и паттернов экспрессии генов тканей мышей, отобранных при аутопсии в контролируемых условиях.

Материалы и методы. Мышей линии Balb/c подвергали эвтаназии с последующей некропсией через 0, 3, 12, 24, 48, 72 ч. Первые 3 ч после эвтаназии мыши находились при комнатной температуре, а затем были перемещены в холодильник (4 °С). Общую РНК выделяли из образцов тканей почек, печени, головного мозга, целостность образцов РНК измеряли при помощи капиллярного электрофореза с расчетом значений RQN (RNA Quality Number). Уровень экспрессии генов домашнего хозяйства Actb, Epas1, Rps18 оценивали при помощи обратно-транскриптазной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-qPCR) с оригинальными праймерами и зондами по технологии TaqMan. Гистологическое исследование выполнено по стандартной методике.

Результаты. Выделенная из тканей почек мышей РНК подвержена деградации в большей степени с увеличением посмертного интервала, чем РНК печени. При этом обнаружена отрицательная линейная зависимость между показателем RQN и длительностью посмертного интервала для образцов печени и почек животных. В то же время образцы РНК головного мозга не демонстрировали существенного изменения показателя RQN во всех временных точках. В тканях почек и печени мышей значительно снижается экспрессия генов Epas1 и Rps18. Однако величина экспрессии генов Epas1 и Rps18 в головном мозге животных остается стабильной во всех временных точках и не демонстрирует значительного снижения через 72 ч после проведения эвтаназии. При гистологическом исследовании не обнаружено явных морфологических изменений, что не исключает наличия ультраструктурных патологических изменений.

Заключение. Величина целостности РНК (RQN) в аутопсийных тканях является важным предиктором качества образца для молекулярно-биологических исследований, включая анализ экспрессии генов.

1. Mackenzie I.R., Neumann M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. Journal of Neurochemistry. 2016;38:54–70. DOI: 10.1111/jnc.13588.

2. Zhu Y., Wang L., Yin Y., Yang E. Systematic analysis of gene expression patterns associated with postmortem interval in human tissues. Scientific Reports. 2017;7(1):5435. DOI: 10.1038/s41598-017-05882-0.

3. Strand C., Enell J., Hedenfalk I., Fernö M. RNA quality in frozen breast cancer samples and the influence on gene expression analysis – a comparison of three evaluation methods using microcapillary electrophoresis traces. BMC Molecular Biology. 2007;8:1–9. DOI: 10.1186/1471-2199-8-38.

4. Kocsmár É., Schmid M., Cosenza-Contreras M., Kocsmár I., Föll M., Krey L. et al. Proteome alterations in human autopsy tissues in relation to time after death. Cellular and Molecular Life Sciences. 2023;80(5):117. DOI: 10.1007/s00018-023-04754-3.

5. Cao L., Huang C., Zhou D.C., Hu Y., Lih T.M., Savage S.R. et al. Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell. 2021;184(19):5031–5052. DOI: 10.1016/j.cell.2021.08.023.

6. Sidova M., Tomankova S., Abaffy P., Kubista M., Sindelka R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;5:3–9. DOI: 10.1016/j.bdq.2015.08.002.

7. Johnson E.S., Stenzel K.E., Lee S., Blalock E.M. Declining RNA integrity in control autopsy brain tissue is robustly and asymmetrically associated with selective neuronal mRNA signal loss. BioRxiv. 2021;2021. DOI: 10.1101/2021.09.07.459326.

8. Fan J., Khani R., Sakamot H., Zhon Y., Michae C., Pen D. et al. Quantification of nucleic acid quality in postmortem tissues from a cancer research autopsy program. Oncotarget. 2016;7(41):66906. DOI: 10.18632/oncotarget.11836.

9. White K., Yang P., Li L., Farshori A., Medina A.E., Zielke H.R. Effect of postmortem interval and years in storage on RNA quality of tissue at a repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 2018;16(2):148–157. DOI: 10.1089/bio.2017.0099.

10. Van der Linden A., Blokker B.M., Kap M., Weustink A.C., Riegman P.H., Oosterhuis J.W. Post-mortem tissue biopsies obtained at minimally invasive autopsy: an RNA-quality analysis. PLoS One. 2014;9(12):e115675. DOI: 10.1371/journal.pone.0115675.

11. Miyahara K., Hino M., Yu Z., Ono C., Nagaoka A., Hatano M. et al. The influence of tissue pH and RNA integrity number on gene expression of human postmortem brain. Frontiers in Psychiatry. 2023;14:1156524. DOI: 10.3389/fpsyt.2023.1156524.

12. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45–45. DOI: 10.1093/nar/29.9.e45/

13. Schroeder A., Mueller O., Stocker S., Salowsky R., Leiber M., Gassmann M. et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 2006;7:1–14. DOI: 10.1186/1471-2199-7-3.

14. Thompson K.L., Pine P.S., Rosenzweig B.A., Turpaz Y., Retief J. Characterization of the effect of sample quality on high density oligonucleotide microarray data using progressively degraded rat liver RNA. BMC Biotechnology. 2007:7:1–12. DOI: 10.1186/1472-6750-7-57.

15. Weickert C.S., Sheedy D., Rothmond D.A., Dedova I., Fung S., Garrick T. et al. Selection of reference gene expression in a schizophrenia brain cohort. Australian & New Zealand Journal of Psychiatry. 2010;44(1):59–70. DOI: 10.3109/00048670903393662.

16. Hostiuc S., Rusu M.C., Mănoiu V.S., Vrapciu A.D., Negoi I., Popescu M.V. Usefulness of ultrastructure studies for the estimation of the postmortem interval. A systematic review. Rom. J. Morphol. Embryol. 2017;58(2):377–384.

17. Kvastad L., Carlberg K., Larsson L., Villacampa E.G., Stuckey A., Stenbeck L. et al. The spatial RNA integrity number assay for in situ evaluation of transcriptome quality. Communications Biology. 2021;4(1):57. DOI: 10.1038/s42003-020-01573-1.

18. Vennemann M., Koppelkamm A. mRNA profiling in forensic genetics I: possibilities and limitations. Forensic Science International. 2010;203(1-3):71–75. DOI: 10.1016/j.forsciint.2010.07.006.

19. Stan A.D., Ghose S., Gao X.M., Roberts R.C., Lewis-Amezcua K., Hatanpaa K.J. et al. Human postmortem tissue: what quality markers matter? Brain Research. 2006;1123(1):1–11. DOI: 10.1016/j.brainres.2006.09.025.

20. Sobue S., Sakata K., Sekijima Y., Qiao S., Murate T., Ichihara M. Characterization of gene expression profiling of mouse tissues obtained during the postmortem interval. Experimental and Molecular Pathology. 2016;100(3):482–492. DOI: 10.1016/j.yexmp.2016.05.007.

21. Heimberger A.B., Crotty L.E., Archer G.E., McLendon R.E., Friedman A., Dranoff G. et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor homogenate induce immunity against syngeneic intracerebral glioma. Journal of Neuroimmunology. 2020;103(1):16–25. DOI: 10.1016/s0165-5728(99)00172-1.

22. Padhi B.K., Singh M., Rosales M., Pelletier G., Cakmak S. A PCR-based quantitative assay for the evaluation of mRNA integrity in rat samples. Biomolecular Detection and Quantification. 2018;15:18–23. DOI: 10.1016/j.bdq.2018.02.001.

23. Fleige S., Pfaffl M.W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 2006;27(2-3):126–139. DOI: 10.1016/j.mam.2005. 12.003.