Эффективность двух доступных наборов для амплификации трех нуклеотидных полиморфизмов, содержащих GC-богатые участки: 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) и -216G/T (rs712829), у больных немелкоклеточным раком легкого

Цель исследования – сравнительный анализ двух доступных наборов, содержащих в одной реакционной смеси все реагенты и добавки, включая 100 mM Tris-НCl, 100 mM KCL, 4 mM MgSO4, 0,2% of Tween 20, необходимых для амплификации трех наиболее часто встречающихся у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) полиморфизмов гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR: 181946 G/A (rs2293347), -191 C/A (rs712830) и -216G/T (rs712829).
Материалы и методы. Протокол для генотипирования 181946C>T, 191C>A и -216G/T был уточнен в соответствии с ранее представленными данными. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) размером 197 bp детектировали с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле с последующим окрашиванием этидиум бромидом.
Результаты. Наборы реактивов Biomaster HS Taq-PCR Color 2× и Biomaster LR HS PCR 2× были эффективны для амплификации 181946 G/A, локализованной в интроне гена EGFR. Кроме того, полиморфизмы -191 C/A (rs712829) и -216G/T (rs712829), расположенные в промоторном участке и содержащие чрезвычайно высокое количество GC, успешно амплифицировались с помощью набора Biomaster LR HS PCR 2×.
Заключение. В настоящем исследовании показано, что наборы реактивов Biomaster HS Taq-PCR Color 2× и Biomaster LR HS PCR 2× эффективны для амплификации 181946 G/A, локализованного в интроне гена EGFR. Кроме того, EGFR SNP -191 C/A, локализованный в промоторном участке с крайне высоким содержанием GC-пар, успешно амплифицировался с помощью набора реактивов Biomaster LR HS PCR 2x.

1. Liu W., Innocenti F., Wu M.H., Desai A.A., Dolan M.E., Cook E.H. et al. A functional common polymorphism in a Sp1 recognition site of the epidermal growth factor receptor gene promoter. Cancer Res. 2005;65(1):46–53. PMID: 15665278.

2. Nomura M., Shigematsu H., Li L., Suzuki M., Takahashi T., Estess P. et al. Polymorphisms, mutations, and amplification of the egfr gene in non-small cell lung cancers. PLoS Med. 2007;4(4):e125. DOI: 10.1371/journal.pmed.0040125.

3. Obradović J., Djordjević N., Tošić N., Mrdjanović J., Stanković B., Stanić J. et al. Frequencies of EGFR single nucleotide polymorphisms in non-small cell lung cancer patients and healthy individuals in the Republic of Serbia: a preliminary study. Tumor Biol. 2016;37(8):10479–10486. DOI: 10.1007/s13277-016-4930-4.

4. Ma F., Sun T., Shi Y., Yu D., Tan W., Yang M. et al. Polymorphisms of EGFR predict clinical outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Lung Cancer. 2009;66(1):114–119. DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.12.025.

5. Obradovic J., Jurisic V., Tosic N., Mrdjanovic J., Perin B., Pavlovic S. et al. Optimization of PCR conditions for amplification of GC-Rich EGFR promoter sequence. J. Clin. Lab. Anal. 2013;27(6):487–493. DOI: 10.1002/jcla.21632.

6. Hubé F., Reverdiau P., Iochmann S., Gruel Y. Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences. Mol. Biotechnol. 2005;31(1):81–84. DOI: 10.1385/MB:31:1:081.

7. Jensen M.A., Fukushima M., Davis R.W. DMSO and betaine greatly improve amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS One. 2010;5(6):e11024. DOI: 10.1371/journal.pone.0011024.

8. Strien J., Sanft J., Mall G. Enhancement of PCR Amplification of moderate GC-containing and highly GC-rich DNA Sequences. Mol. Biotechnol. 2013;54(3):1048–1054. DOI: 10.1007/s12033-013-9660-x.

9. Jurišić V., Obradović J., Tošić N., Pavlović S., Kulić M., Djordjević N. Effects of DMSO, glycerol, betaine and their combinations in detecting single nucleotide polymorphisms of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene promoter sequence in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016;128:275–279. DOI: 10.1016/j.jpba.2016.05.010.

10. Lorenz T.C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 2012;(63):e3998. DOI: 10.3791/3998.

11. Sahdev S., Saini S., Tiwari P., Saxena S., Singh Saini K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol. Cell Probes. 2007;21(4):303–307. DOI: 10.1016/j.mcp.2007.03.004.

12. Naz S., Fatima A. Amplification of GC-rich DNA for high-throughput family based genetic studies. Mol. Biotechnol. 2013;53(3):345–350. DOI: 10.1007/s12033-012-9559-y.

13. Wei M., Deng J., Feng K., Yu B., Chen Y. Universal method facilitating the amplification of extremely GC-rich DNA fragments from genomic DNA. Anal. Chem. 2010;82(14):6303–6307. DOI: 10.1021/ac100797t.

14. Bachmann B., Luke W., Hunsmann G. Improvement of PCR amplified DNA sequencing with the aid of detergents. Nucleic Acids Res. 1990;18(5):1309. DOI: 10.1093/nar/18.5.1309.