In vitro и in vivo реакция остеогенных клеток на высокотемпературное воздействие

Цель исследования: оценить реакцию мезенхимных стромальных/стволовых клеток (МСК) in vitro и состояние костных клеток (остеобластов, остеоцитов) в процессе восстановления бедренной кости после локальной термоабляции в диапазоне 55–60 °C.
Материалы и методы. Морфологию и жизнеспособность (МТТ-тест) культуры МСК, выделенной из жировой ткани человека, изучали при культивировании в термостатах при 37 °C или 56 °C в диапазоне 0–60 мин. На бедренную кость наркотизированных кроликов накладывали нагревательную манжету и проводили интраоперационную термоабляцию в течение 30 мин (температура в костно-мозговом канале 55–60°C). Состояние костной ткани анализировали гистологически (окраска гематоксилином и эозином и по Эйнарсону) сразу и через 14 сут после воздействия. Проводили компьютерную морфометрию с использованием ImageJ и статистический анализ в R.
Результаты. Морфологические признаки массовой гибели МСК в культуре in vitro наблюдались через 15 мин нагревания; через 30 мин живые фибробластоподобные клетки практически отсутствовали. Прижизненная локальная термоабляция бедренной кости кроликов вызывала прямую гибель остеобластов и остеоцитов, зафиксированную по морфологическим признакам апоптоза и некроза, а также нарушению синтеза ДНК и РНК. Морфологические и молекулярные маркеры клеточного повреждения статистически значимо увеличивались к 14-м сут после нагревания.
Заключение. Умеренные режимы термоабляции (55–60 °C) обладают значительным прямым и отсроченным повреждающим эффектом на остеогенные клетки от стволовых до зрелых форм. Полученные результаты важны для практики комбинированного лечения опухолевых и метастатических поражений костной ткани.

1. Huang S., Jin M., Su N., Chen L. New insights on the reparative cells in bone regeneration and repair. Biological Reviews. 2021;96(2):357–375. DOI: 10.1111/brv.12659.

2. Trompet D., Melis S., Chagin A.S., Maes C. Skeletal stem and progenitor cells in bone development and repair. Journal of Bone and Mineral Research. 2024;39(6):633–654. DOI: 10.1093/jbmr/zjae069.

3. Анисеня И.И., Ситников П.К., Пахмурин Д.О., Пахмурина В.В., Васильев Н.В., Зельчан Р.В. и др. Радикальная интраоперационная термоабляция остеогенной саркомы: клиническое наблюдение. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2023;15(3):34–45. DOI: 10.17650/2782-3687-2023-15-3-34-45.

4. Payne M., Bossmann S.H., Basel M.T. Direct treatment versus indirect: Thermo-ablative and mild hyperthermia effects. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2020;12(5): e1638. DOI: 10.1002/wnan.1638.

5. Ota T., Nishida Y., Ikuta K., Kato R., Kozawa E., Hamada S. et al. Heat-stimuli-enhanced osteogenesis using clinically available biomaterials. PLoS One. 2017;12(7): e0181404. DOI: 10.1371/journal.pone.0181404.

6. Leon S.A., Asbell S.O., Arastu H.H., Edelstein G., Packel A.J., Sheehan S. et al. Effects of hyperthermia on bone. II. Heating of bone in vivo and stimulation of bone growth. International Journal of Hyperthermia. 1993;9(1):77–87. DOI: 10.3109/02656739309061480.

7. Ikuta K., Urakawa H., Kozawa E., Hamada S., Ota T., Kato R. et al. In vivo heat-stimulus-triggered osteogenesis. International Journal of Hyperthermia. 2015;31(1):58–66. DOI: 10.3109/02656736.2014.988662.

8. Pakhmurin D., Pakhmurina V., Kashin A., Kulkov A., Khlusov I., Kostyuchenko E. et al. Compressive strength characteristics of long tubular bones after hyperthermal ablation. Symmetry (Basel). 2022;14(2):303. DOI: 10.3390/sym14020303.

9. Pakhmurin D., Pakhmurina V., Kashin A., Kulkov A., Khlusov I., Kostyuchenko E. et al. Mechanical and Hhistological Ccharacteristics of Hhuman Ttubular Bbones after Hhyperthermal Ttreatment. Symmetry (Basel). 2023;15(1):156. DOI: 10.3390/sym15010156.

10. Горохова А.В., Насибов Т.Ф., Порохова Е.Д., Бариев У.А., Носов В.Е., Пахмурин Д.О. и др. Состояние костной ткани в ранние сроки восстановления после термического воздействия. Морфология. 2024;162(3):298–315. DOI: 10.17816/morph.634692.

11. Flour M.P., Ronot X., Vincent F., Benoit B., Adolphe M. Differential temperature sensitivity of cultured cells from cartilaginous or bone origin. Biology of the Cell. 1992;75(1):83–87. DOI: 10.1016/0248-4900(92)90127-M.

12. Rühle A., Thomsen A., Saffrich R., Voglstätter M., Bieber B., Sprave T. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells are sensitive to thermic stress–potential implications for therapeutic hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 2020;37(1):430–441. DOI: 10.1080/02656736.2020.1758350.

13. Piras A., la Vecchia M., Boldrini L., D’Aviero A., Galanti D., Guarini A. et al. Radiofrequency thermoablation (RFA) and radiotherapy (RT) combined treatment for bone metastases: A systematic review. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2021;25(10):3647-3654. DOI: 10.26355/eurrev_202105_25930.

14. Ringe K.I., Panzica M., Von Falck C. Thermoablation of bone tumors. RöFo-Fortschritte auf dem Gebiet der Röntgenstrahlen und der bildgebenden Verfahren. 2016;188(06):539–550. DOI: 10.1055/s-0042-100477.

15. Brace C. Thermal tumor ablation in clinical use. IEEE Pulse. 2011;2(5):28–38. DOI: 10.1109/MPUL.2011.942603.

16. Zhao Z., Du Y., Yan K., Zhang L., Guo Q. Exercise and osteoimmunology in bone remodeling. The FASEB Journal. 2024;38(7):e23554. DOI: 10.1096/fj.202301508RRR.

17. Khlusov I., Yurova K., Shupletsova V., Khaziakhmatova O., Malashchenko V., Kudryavtseva V. et al. Microcapsule-Based Dose-Dependent Regulation of the Lifespan and Behavior of Adipose-Derived MSCs as a Cell-Mediated Delivery System: In Vitro Study. International Journal of Molecular Sciences. 202;24(1):292. DOI: 10.3390/ijms24010292.

18. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Krause D.S. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315–317. DOI: 10.1080/14653240600855905.

19. Evtushenko D.N., Fateev A.V., Khainovsky M.A., Polishchuk J., Kokorev O.V., Nasibov T.F. et al. Intermolecular interactions, regioselectivity, and biological activity of l-ascorbic acid, nicotinic acid and their cocrystal. Cryst. Eng. Comm. 2024;26(46):6650–6666. DOI: 10.1039/D4CE00770K.

20. Пахмурин Д.О., Пахмурина В.В., Анисеня И.И., Ситников П.К. Экспериментальное изучение распределения температуры в длинных трубчатых костях при периоссальном расположении нагревателей. Сибирский онкологический журнал. 2023;22(2):65–75. DOI: 10.21294/1814-4861-2023-22-2-65-75.

21. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996:544.

22. Pearse A.G.E. Histochemistry, Ttheoretical and аapplied: theoretical and applied. London: Churchill Livingstone. 1968:759.

23. Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980:343.

24. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Зайцев К.В., Салмина А.Б., Шахова С.С. и др. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. Томск: STT, 2004:385.

25. Korkmaz S., Goksuluk D., Zararsiz G. MVN: An R package for assessing multivariate normality. The R Journal. 2014;6(2):151–162.

26. Documentation for package ‘stats’ version 4.4.1. The R Stats Package [Internet]. Available: [cited 2024 Jul 21]. URL: Available from: https://search.r-project.org/R/refmans/stats/html/00Index.html

27. Brunnermunzel (version 2.0). Rdocumentation [Internet]. Available: [cited 2024 Jul 21]. URL: Available from: https://www.rdocumentation.org/packages/brunnermunzel/versions/2.0

28. Royston P. Remark AS R94: A Remark on Algorithm AS 181: The W-test for Normality. Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics). 1995;44(4):547–551. DOI: 10.2307/2986146.

29. Smith H.F. The problem of comparing the results of two experiments with unequal errors. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 1936;9:211–212.

30. Satterthwaite F.E. An approximate distribution of estimates of variance components. Biometrics Bulletin. 1946;2(6):110–114. DOI: 10.2307/3002019.

31. Welch B.L. The Significance of the difference between two means when the population variances are unequal. Biometrika. 1938;29(3/4):350–362. DOI: 10.2307/2332010.

32. Moser B.K., Stevens G.R., Watts C.L. The Two-Sample T Test Versus Satterthwaite’s Approximate F Test. Communications in Statistics – Theory and Methods. 1989;18(11):3963–3975. DOI: 10.1080/03610928908830135.

33. Ruxton G.D. The unequal variance t-test is an underused alternative to Student’s t-test and the Mann – Whitney U test. Behavioral Ecology. 2006;17(4):688–690. DOI: 10.1093/beheco/ark016.

34. Zimmerman D.W., Zumbo B.D. Rank transformations and the power of the Student t test and Welch t’ test for non-normal populations with unequal variances. Canadian Journal of Experimental Psychology/Revue canadienne de psychologie expérimentale. 1993;47(3):523–539. DOI: 10.1037/h0078850.

35. Brunner E., Munzel U. The nonparametric ehrensFisher problem: aasymptotic Ttheory and a small-sample approximation. Biometrical Journal. 2000;42(1):17–25. DOI: 10.1002/(SICI)1521-4036(200001)42:1<17::AID-BIMJ17>3.0.CO;2-U.

36. Munzel U., Brunner E. Nonparametric tests in the unbalanced multivariate one-way design. Biometrical Journal. 2000;42(7):837–854. DOI: 10.1002/1521-4036(200011)42:7<837::AID-BIMJ837>3.0.CO;2-S.

37. Karch J.D. Psychologists should use Brunner-Munzel’s instead of Mann-Whitney’s U Test as the default nonparametric procedure. Advances in Methods and Practices in Psychological Science. 2021;4(2):2515245921999602. DOI: 10.1177/2515245921999602.

38. Noguchi K., Konietschke F., Marmolejo-Ramos F., Pauly M. Permutation tests are robust and powerful at 0.5% and 5% significance levels. Behavior Research Methods. 2021;53(6):2712–2724. DOI: 10.3758/s13428-021-01595-5.

39. Galluzzi L., Maiuri M.C., Vitale I., Zischka H., Castedo M., Zitvogel L. et al. Cell death modalities: Classification and pathophysiological implications. Cell Death & Differentiation. 2007;14(7):1237–1243. DOI: 10.1038/sj.cdd.4402148.

40. Ahmed K., Tabuchi Y., Kondo T. Hyperthermia: an effective strategy to induce apoptosis in cancer cells. Apoptosis. 2015;20(11):1411–1419. DOI: 10.1007/s10495-015-1168-3.

41. Suzuki M., Shinkai M., Honda H., Kobayashi T. Anticancer effect and immune induction by hyperthermia of malignant melanoma using magnetite cationic liposomes. Melanoma Research. 2003;13(2):129–135. DOI: 10.1097/00008390-200304000-00004.

42. Vaupel P.W., Kelleher D.K. Metabolic status and reaction to heat of normal and tumor tissue in thermoradiotherapy and thermochemotherapy. Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 1995:483.

43. Yanase M., Shinkai M., Honda H., Wakabayashi T., Yoshida J., Kobayashi T. Antitumor immunity induction by intracellular hyperthermia using magnetite cationic liposomes. Japanese Journal of Cancer Research. 1998;89(7):775–782. DOI: 10.1111/j.1349-7006.1998.tb03283.x.

44. Fisher D.T., Chen Q., Skitzki J.J., Muhitch J.B., Zhou L., Appenheimer M.M. et al. IL-6 trans-signaling licenses mouse and human tumor microvascular gateways for trafficking of cytotoxic T cells. Journal of Clinical Investigation. 2011;121(10):3846–3859. DOI: 10.1172/JCI44952.

45. Kong G., Braun R.D., Dewhirst M.W. Characterization of the effect of hyperthermia on nanoparticle extravasation from tumor vasculature. Cancer Research. 2001;61(7):3027–3032.

46. Meyer R.E., Braun R.D., Rosner G.L., Dewhirst M.W. Local 42°C hyperthermia improves vascular conductance of the R3230Ac rat mammary adenocarcinoma during sodium nitroprusside infusion. Radiation Research. 2000;154(2):196–201. DOI: 10.1667/0033-7587(2000)154[0196:LCHIVC]2.0.CO;2.

47. Song C.W., Shakil A., Griffin R.J., Okajima K. Improvement of tumor oxygenation status by mild temperature hyperthermia alone or in combination with carbogen. Seminars in Oncology. 1997;24(6):626–632.

48. Toraya-Brown S., Sheen M.R., Zhang P., Chen L., Baird J.R., Demidenko E. et al. Local hyperthermia treatment of tumors induces CD8+ T cell-mediated resistance against distal and secondary tumors. Nanomedicine. 2014;10(6):1273–1285. DOI: 10.1016/j.nano.2014.01.011.

49. Choudhery M.S., Badowski M., Muise A., Harris D.T. Effect of mild heat stress on the proliferative and differentiative ability of human mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2015;17(4):359–368. DOI: 10.1016/j.jcyt.2014.11.003.

50. Reissis Y., García-Gareta E., Korda M., Blunn G.W., Hua J. The effect of temperature on the viability of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 2013;4(6):139. DOI: 10.1186/scrt350.

51. Lavelle C., Wedgwood D. Effect of internal irrigation on frictional heat generated from bone drilling. Journal of Oral Surgery. 1980;38(7):499–503.

52. Tetsch P. Development of raised temperature after osteotomies. Journal of maxillofacial surgery. 1974;2:141–145. DOI: 10.1016/S0301-0503(74)80030-5.

53. Eriksson A., Albrektsson T., Grane B., McQueen D. Thermal injury to bone: A vital-microscopic description of heat effects. International Journal of Oral Surgery. 1982;11(2):115–121. DOI: 10.1016/S0300-9785(82)80020-3.

54. Lehnartz E. Einführung in die Chemische Physiologie. Heidelberg: Springer Berlin, 1959:627. DOI: 10.1007/978-3-642-86501-5.

55. Matthews L.S., Hirsch C. Temperatures measured in human cortical bone when drilling. The Journal of Bone & Joint Surgery. 1972;54(2):297–308.

56. Li S., Chien S., Brånemark P.I. Heat shock-induced necrosis and apoptosis in osteoblasts. Journal of Orthopaedic Research. 1999;17(6):891–899. DOI: 10.1002/jor.1100170614.

57. Qi H., Jin S., Yin C., Chen L., Sun L., Liu Y. Radial extracorporeal shock wave therapy promotes osteochondral regeneration of knee joints in rabbits. Experimental and Therapeutic Medicine. 2018;16(4):3478–3484. DOI: 10.3892/etm.2018.6631.

58. Robling A.G., Bonewald L.F. The osteocyte: new insights. Annual Review of Physiology. 2020;82(1):485–506. DOI: 10.1146/annurev-physiol-021119-034332.

59. Дружинина Т.В., Хлусов И.А., Карлов А.В., Ростовцев А.В. Маркеры остеогенеза в периферической крови как патогенетические факторы и предикторы системных эффектов имплантатов для остеосинтеза. Гений ортопедии. 2007;4:83–88.

60. Tate M.L.K., Adamson J.R., Tami A.E., Bauer T.W. The osteocyte. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2004;36(1):1–8. DOI: 10.1016/S1357-2725(03)00241-3.

61. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143–147. DOI: 10.1126/science.284.5411.143.

62. Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S.A., Abrams J.M., Adam D., Agostinis P. et al. Molecular mechanisms of cell death: Rrecommendations of the nomenclature committee on cell death 2018. Cell Death & Differentiation. 2018;25(3):486–541. DOI: 10.1038/s41418-017-0012-4.

63. Ruggiero C., Bonamassa L., Pelini L., Prioletta I., Cianferotti L., Metozzi A. et al. Early post-surgical cognitive dysfunction is a risk factor for mortality among hip fracture hospitalized older persons. Osteoporosis International. 2017;28(2):667–675. DOI: 10.1007/s00198-016-3784-3.

64. Shu L., Bai W., Shimada T., Ying Z., Li S., Sugita N. Thermographic assessment of heat-induced cellular damage during orthopedic surgery. Medical Engineering & Physics. 2020;83:100–105. DOI: 10.1016/j.medengphy.2020.05.014.

65. Ebata T., Terkawi M.A., Kitahara K., Yokota S., Shiota J., Nishida Y. et al. Noncanonical pyroptosis triggered by Mmacrophage-derived extracellular vesicles in chondrocytes leading to cartilage catabolism in osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 2023;75(8):1358–1369. DOI: 10.1002/art.42505.

66. Frisch S.M., Ruoslahti E. Integrins and anoikis. Current Opinion in Cell Biology. 1997;9(5):701–706. DOI: 10.1016/S0955-0674(97)80124-X.

67. Ruoslahti E., Reed J. New way to activate caspases. Nature. 1999;397(6719):479–480. DOI: 10.1038/17229.

68. Adams C.S., Shapiro I.M. Mechanisms by which extracellular matrix components induce osteoblast apoptosis. Connective Tissue Research. 2003;44(1):230–239. DOI: 10.1080/03008200390181717