РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO

В основе патогенеза многих распространенных и социально-значимых заболеваний лежит формирование окислительного стресса. Лимфоциты крови являются клетками, обеспечивающими иммунологический контроль организма. В результате происходит контакт лимфоцитов крови с различными эндогенными и экзогенными факторами, что может приводить к интенсификации продукции активных форм кислорода, окислительной модификации макромолекул и изменению выживаемости клеток. Актуальным является расширение и углубление фундаментальных знаний об особенностях регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

Цель исследования – установить взаимосвязь между изменением состояния системы глутатиона, уровнем карбонилирования, глутатионилирования белков и активностью каспазы-3 в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили лимфоциты крови, культивированные с добавлением пероксида водорода в конечной концентрации 0,5 ммоль и (или) блокатора SH-групп протеинов N-этилмалеимида – 5 ммоль, протектора – 5 ммоль – 1,4-дитиоэритритола. Методом спектрофотометрии определяли концентрацию восстановленного, окисленного и белковосвязанного глутатиона, дополнительно рассчитывали величину соотношения восстановленной фракции тиола к окисленной. С помощью иммуно-ферментного анализа оценивали уровень карбонильных производных протеинов, активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом.

Результаты. Блокирование SH-групп протеинов в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалось резким падением концентрации белково-связанного глутатиона на фоне увеличения содержания карбонильных производных белков и активности каспазы-3. Протекция SH-групп белков в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалась возрастанием концентрации белково-связанного глутатиона, карбонильных производных протеинов при сопоставимых значениях активности изучаемого фермента.

Выводы. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что каспаза-3 и белково-связанный глутатион являются молекулярными мишенями селективного управления программированной клеточной гибелью. Полученные показатели изменения активности каспазы-3 и концентрации белково-связанного глутатиона в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro могут быть использованы при разработке подходов таргетной терапии заболеваний, сопровождающихся дисрегуляцией апоптоза.

1. Hдcker H.G., Sisay M.T., Gьtschow M. Allosteric modulation of caspases // Pharmacology & therapeutics. 2011. 132 (2). P. 180–195.

2. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глутатион ядра клетки и его функции // Биомед. химия. 2010. Т. 56, № 6. C. 657–662.

3. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О. Некоторые принципы и механизмы редокс-регуляции // Кислород и антиоксиданты. 2009. № 1. С. 3–64.

4. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб.: Мед. пресса, 2006. 400 с.

5. Иванов А.С. Основные принципы конформационного разнообразия белков для медико-биологов // Биомед. химия. 2011, Т. 57, № 1. С. 31–60.

6. Bignold L.P., Ferrante A. Mechanism of separation of polymorphonuclear leukocytes from whole blood by the onestep Hypaque-Ficoll method // Journal of Immunological Methods. 1987. V. 96, № 1. P. 29–33.

7. Ulmer A.J., Flad H.D. Discontinuous density gradient separation of human mononuclear leukocytes using Percoll as gradient medium // Journal of Immunological Methods. 1979. V. 30, № 1. P. 1–10.

8. Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Коновалова Е.В., Носарева О.Л., Наумова А,И., Орлов Д.С., Веснина О.Н., Новицкий В.В. Моделирование окислительного стресса в лимфоцитах крови in vitro для изучения апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat // Казанский мед. журн. 2013. Т. XCIV, № 5. С. 736–740.

9. Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli // Archives of biochemistry and biophysics. 1995. V. 316. P. 327–333.

10. Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. Lymphocyte surface thiol levels // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. V. 100, № 7. P. 4001–4005.

11. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth // Journal of radiation research. 2004. V. 45, № 1. P. 33–39.

12. Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B., Leinbach E.D., Berlin R.D. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes // Journal of Cell Biology. 1978. V. 76, № 2. P. 439–447.

13. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // The Biochemical Journal. 1997. V. 326. P. 1–16.

14. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death // Cell Death and Differentiation. 1999. № 6. P. 1028–1042.

15. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. V. 7, № 1. P. 248–254.

16. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.

17. Wang J.Y., Lee C.T., Wang J.Y. Nitric oxide plays a dual role in the oxidative injury of cultured rat microglia but not astroglia // Neuroscience. 2014. V. 281. P. 164–177.

18. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях // Украинский биохим. журн. 2008. Т. 80, № 6. С. 5–18