Новый подход к оценке эффективности антигельминтных средств in vitro

Цель. Разработать новый метод определения жизнеспособности описторхов in vitro с использованием MTS-реактива и оценить его применимость для анализа эффективности антигельминтных средств при лечении описторхоза.

Материалы и методы. Для создания модели инвазии O. felineus использовались золотистые сирийские хомяки. Животные инфицировались метацеркариями, полученными из рыб семейства карповых. Спустя 3 мес после заражения взрослые особи паразитов (мариты) извлеклись из гепатобилиарной системы. Жизнеспособность марит оценивалась с помощью шкалы подвижности и нового метода, основанного на модификации протокола MTS-теста. Для учета различий между размерами и количеством клеток марит результаты были нормализованы относительно содержания белка. Для оценки возможности применения нового подхода в изучении противоописторхозной фармакологической активности проверена жизнеспособность марит в присутствии празиквантела.

Результаты. При инкубации марит описторхов в среде с добавлением МТS-реактива происходит накопление окрашенного водорастворимого формазана. Термическое инактивирование паразитов значительно снижает продукцию этого соединения. Так как исследуемые мариты различались по размеру и количеству клеток, полученные данные об их жизнеспособности были нормированы на содержание белка. Результаты коррелируют с данными о жизнеспособности паразитов, полученными традиционным методом с использованием шкалы подвижности. Оценка эффективности празиквантела в разных концентрациях с помощью двух независимых методов (МТS-тест и шкала подвижности) показала, что результаты MTS-теста согласуются с литературными данными и сопоставимы с результатами, полученными с использованием шкалы подвижности.

Заключение. Разработан новый метод оценки противоописторхозной активности лекарственных препаратов in vitrо, основанный на оценке продукции водорастворимого формазана маритами O. felineus в среде культивирования с использованием MTS-реагента для скрининга противоописторхозной активности новых антигельминтных препаратов.

1. Pakharukova M.Y., Mordvinov V.A. The liver fluke Opisthorchis felineus: biology, epidemiology and carcinogenic potential. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2016;110(1):28–36. DOI: 10.1093/trstmh/trv085.

2. Fedorova O.S., Kovshirina A.E., Kovshirina Y.V., Hattendorf J., Onishchenko S.V., Katanakhova L.L. et al. Opisthorchis felineus infection is a risk factor for cholangiocarcinoma in Western Siberia: A hospital-based case-control study. Clinical Infectious Diseases. 2023;7(3):e1392–e1398. DOI: 10.1093/cid/ciac497.

3. Khalil R.G., Ibrahim A.M., Bakery H.H. Juglone: “A novel immunomodulatory, antifibrotic, and schistosomicidal agent to ameliorate liver damage in murine schistosomiasis mansoni”. International Immunopharmacology. 2022;113:109415. DOI: 10.1016/j.intimp.2022.109415.

4. Pakharukova M.Y., Samsonov V.A., Serbina E.A., Mordvinov, V.A. A study of tribendimidine effects in vitro and in vivo on the liver fluke Opisthorchis felineus. Parasites Vectors. 2019;12(23):1–6. DOI: 10.1186/s13071-019-3288-z.

5. Harder A. Activation of transient receptor potential channel Sm. (Schistosoma mansoni) TRPM PZQ by PZQ, enhanced Ca++ influx, spastic paralysis, and tegumental disrupture-the deadly cascade in parasitic schistosomes, other trematodes, and cestodes. Parasitology Research. 2020;119:2371–2382. DOI: 10.1007/s00436-020-06763-8.

6. Spangenberg T. Alternatives to praziquantel for the prevention and control of schistosomiasis. ACS Infectious Diseases. 2020;7(5):939–942. DOI: 10.1021/acsinfecdis.0c00542.

7. Detoni M.B., Bortoleti B.T.D.S., Tomiotto-Pellissier F., Concato V.M., Gonçalves M.D., Silva T.F. et al. Biogenic silver nanoparticle exhibits schistosomicidal activity in vitro and reduces the parasitic burden in experimental Schistosomiasis mansoni. Microbes and Infection.2023;25(7):105145. DOI: 10.1016/j.micinf.2023.105145.

8. Rehman L., Ullah R., Rehman A., Khan M.A.H., Beg M.A., Wasim S. et al. Clinostomum complanatum: Anthelmintic potential of curcumin on the infective progenetic metacercarial stage. Experimental Parasitology. 2023;249:108514. DOI: 10.1016/j.exppara.2023.108514.

9. Aslantürk Ö.S. In vitro cytotoxicity and cell viability assays: principles, advantages, and disadvantages. Genotoxicity-A Predictable Risk to Our Actual World. 2018;64–80. DOI: 10.5772/intechopen.71923.

10. Mourão M.M., Dinguirard N., Franco G.R., Yoshino T.P. Role of the endogenous antioxidant system in the protection of Schistosoma mansoni primary sporocysts against exogenous oxidative stress. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2009;3(11):e550. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000550.

11. Moné Y., Mitta G., Duval D., Gourbal B.E. E Effect of amphotericin B on the infection success of Schistosoma mansoni in Biomphalaria glabrata. Experimental Parasitology. 2019;125(2):70–75. DOI: 10.1016/j.exppara.2009.12.024.

12. De Paula R.G., de Magalhães Ornelas A.M., Morais E.R., de Souza Gomes M., de Paula Aguiar D. et al. Proteasome stress responses in Schistosoma mansoni. Parasitology Research. 2015;114:1747–1760. DOI: 10.1007/s00436-015-4360-z.

13. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К., 2012:944.

14. Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Pirozhkova D.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. The first comprehensive study of praziquantel effects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda). International Journal of Antimicrobial Agents. 2015;46(1):94–100. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2015.02.012.

15. Wong Y., Pearson M.S., Fedorova O., Ivanov V., Khmelevskaya E., Tedla B. et al. Secreted and surface proteome and transcriptome of Opisthorchis felineus. Frontiers in Parasitology. 2023;1195457. DOI: 10.3389/fpara.2023.1195457.

16. Olson B.J., Markwell J. Assays for determination of protein concentration. Current Protocols in Pharmacology. 2007;38(1):A–3A. DOI: 10.1002/0471140864.ps0304s48.

17. Marcos L., Maco V., Terashima A. Triclabendazole for the treatment of human fascioliasis and the threat of treatment failures. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 2021;19(7):817–823.

18. Olliaro P., Delgado-Romero P., Keiser J. The little we know about the pharmacokinetics and pharmacodynamics of praziquantel (racemate and R-enantiomer). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2014;69(4):863–870. DOI: 10.1093/jac/dkt491.

19. Oliveira M.F., d’Avila J.C., Tempone A.J., Soares J.B., Rumjanek F.D., Ferreira-Pereira A. et al. Inhibition of heme aggregation by chloroquine reduces Schistosoma mansoni infection. Journal of Infectious Diseases. 2004;190(4):843–852. DOI: 10.1086/422759.

20. Ghasemi M., Turnbull T., Sebastian S., Kempson I. The MTT assay: utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(23):12827. DOI: 10.3390/ijms222312827.

21. Stockert J.C., Horobin R.W., Colombo L.L., Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 2018;120(3):159–167. DOI: 10.1016/j.acthis.2018.02.005.

22. Stone V., Johnston H., Schins R.P. Development of in vitro systems for nanotoxicology: methodological considerations. Critical Reviews in Toxicology. 2009;39(7):613–626. DOI: 10.1080/10408440903120975.

23. Keiser J., Manneck T., Vargas M. Interactions of mefloquine with praziquantel in the Schistosoma mansoni mouse model and in vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2011;66(8):1791–1797. DOI: 10.1093/jac/dkr178.